生物肥料對當歸生長及土壤酶活性、微生物多樣性的影響

李 娟，王文麗，趙 旭

（甘肅省農業科學院土壤肥料與節水農業研究所，甘肅 蘭州 730070）

【研究意義】當歸（Angelica sinensis）為常用中藥材，屬中醫婦科用藥，是補血活血、去瘀生新、潤腸通便、調經止痛的良好藥物［1-2］。當歸主產甘肅、陜西、云南和四川，有效成分為阿魏酸［3］、多糖、揮發油等，阿魏酸具有清除自由基的作用，能抑制血小板聚集和血栓形成［4］。甘肅當歸產量最大、質量最好，栽培歷史最為悠久［5］。甘肅當歸正常年產量約1萬t左右，占全國年產量95%以上，是當地最具優勢的特色藥材之一［6］。甘肅當歸的主產區在岷縣，還有周邊的渭源縣、康樂縣、卓尼縣、宕昌縣。隨著當歸需求量日益增加，大量種植造成連作面積不斷提高，多年連作導致當歸生長發育不良，產品品質及產量下降，抗病能力降低，土壤環境逐年惡化，根病加重［7］。而導致土壤環境惡化的原因是連作使部分土壤養分異常積累，另一部分養分過度消耗，病原微生物迅速繁衍，土壤微生物種群結構失調，引發作物品質及產量下降［8-10］。有些生物有機肥所含的微生物對病菌有抑制作用。【前人研究進展】微生物菌劑和生物有機肥已應用在多種作物上，施用生物有機肥（菌肥）可有效改善土壤性質、提高土壤養分，通過增加根系活力、提高作物對營養元素的吸收利用使作物增產或提高抗病性［11］。微生物菌劑和有機肥在當今農業生產中越來越受重視，生物肥料在設施蔬菜［13］、馬鈴薯［14］、玉米［15］、水稻［16］、果樹［17］等多種作物上都有顯著增產效果，促進作物對養分的吸收，增強作物的抗病性。用于生產生物肥料的菌種種類很多，據不完全統計，已發現包括假單胞菌和芽胞桿菌等20多個屬的根圍細菌具有防病促生潛能［12］。但針對當歸的專用抗病促生生物肥料較少。【本研究切入點】抗病型生物肥料DZF-363是由抗病菌株DG-16-2、DG-23復合而成。DG-16-2、DG-23是從當歸根際分離的具有抑制鐮刀菌等病原微生物生長的拮抗菌株，對當歸有顯著促生效果。【擬解決的關鍵問題】為探明生物肥料DZF-363的作用機理，進行了生物肥料在當歸上的盆栽試驗，以期為肥料的推廣和當歸安全生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生物肥料DZF-363由甘肅省農業科學院土壤肥料與節水農業研究所微生物研究室提供，含有機質442 g/kg、全氮10.82 g/kg、全磷5.1 g/kg、全鉀12.3 g/kg、全鹽17.22 g/kg、pH7.5、兩種菌（壁芽孢桿菌Bacillus muralisDG-23和油菜假單胞菌PseudomonasbrassicacearumDG-16-2）的活菌數均≥2.5×108cfu/g。

1.2 試驗方法

試驗設施用載體10 g/盆、生物肥料DZF-363 10 g/盆和空白對照3個處理，每個處理8次重復。

試驗在甘肅省農業科學院溫室大棚進行，采用塑料花盆，每盆裝土750 g、蛭石粉150 g。移栽前將土樣750 g與150 g蛭石粉、10 g生物肥料（或載體）充分混勻后裝盆。移栽前灌水按基質重的35%計，即每盆灌水375 mL。每個處理裝盆10盆，當歸每盆移栽2株，生長30 d后每處理選擇長勢良好的8盆作為重復，定植1株，生長90 d后收獲，測定當歸地上部、地下部鮮重和干重；取新鮮土壤過1 mm篩進行土壤脲酶、磷酸酶活性及微生物群落多樣性測定。試驗于2019年3月23日移栽，4月25日定苗，7月29日收獲。

當歸植株的收獲及土樣取樣：將當歸與土全部從花盆倒出，把周圍土抖落，將根上的土抖到牛皮紙上，植株裝入塑料袋中，土樣每兩盆混合均勻裝入1個自封袋中。將根沖洗干凈后用紙吸干水，進行稱重；植株進行株高、根長、根粗測量，風干后分別稱地上部和根干重。

土壤中可培養的微生物（細菌、真菌、放線菌）采用稀釋平板法測定；土壤脲酶活性測定采用靛酚比色法，磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法［18］。

土壤微生物群落碳代謝多樣性采用Biolog-MicroPlate方法進行［19-20］：稱取10 g新鮮土壤加入裝有90 mL無菌生理鹽水錐形瓶中（0.85%NaCl溶液）。搖床振蕩30 min，靜置30 min，取上清液5 mL加入到45 mL無菌生理鹽水中，稍加振蕩后倒入V型接種槽，用八道移液器接種到Biolog Eco微平板，每個孔接種150 μL，25℃培養192 h，每24 h讀數1次，將OD值導出，用590 nm的OD值減去750 nmOD值的差值計算平均顏色變化率、豐富度等。

（1）平均顏色變化率（average well color development，AWCD），表示微生物群落的碳源代謝強度，是土壤微生物活性及功能多樣性的一個重要指標［21-22］。采用各Eco-MicroPlate吸光值數據計算：

式中，Ci為除對照孔外各孔590 nm的OD值減去750 nm的OD值差，R為對照孔590 nm的OD值減去750 nm的OD值的差，n為31種碳源。

（2）Shannon-Wiener物種豐富度指數（H’），用于評估群落的物種豐富度：

式中，Pi為不同碳源的微孔和對照孔吸光值的差值與整個微板總體差值之和的比值：

式中，Ci為每個微板孔590 nm的OD值減去750 nm的OD值差，R為對照孔590 nm的OD值減去750 nm的OD值的差，n為31種碳源。

（3）McIntosh物種均一度指數（U）。

式中，ni為第i反應孔與對照孔的差值（ni=Ci-R）。

（4）辛普森指數又稱優勢度指數（D），是對多樣性方面的集中性度量。

試驗數據采用Microsoft Excel 2003進行處理，采用DPS統計軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 生物肥料對當歸生長的影響

表1結果顯示，施用生物肥料和載體處理對當歸根生長都有顯著促進作用，尤其是對當歸根干重、蘆頭直徑有顯著促進作用。與對照相比，施用生物肥料后當歸的根干重、蘆頭直徑分別增加100.5%、31.39%，施用載體處理當歸的根干重、蘆頭直徑分別增加28.1%、10.31%，差異顯著。

表1 不同處理對當歸生長的影響Table 1 Effects of different treatments on the growth of A. sinensis

2.2 生物肥料對當歸根際土壤微生物數量的影響

試驗結果（表2）表明，在當歸根際施用生物肥料可以顯著增加根際土壤細菌、真菌、防線菌數量。與對照相比，生物肥料處理細菌、真菌、放線菌分別增加154%、21.6%、34.7%，差異顯著，載體處理分別增加78%、20.1%、6.5%；生物肥料處理與載體處理相比，細菌、真菌、放線菌分別增加42.6%、1.27%、26.5%。說明生物肥料中的有機物料能顯著增加土壤中細菌和真菌數量，而菌劑的加入使土壤細菌和放線菌的數量大幅度提高。

細菌與放線菌之和與真菌數量的比值是土壤微生物區系結構的重要特征指標［23］。通過細菌和放線菌數量之和與真菌數量的比值分析土壤中微生物的群落結構，從表2可以看出，使用生物肥料可以顯著改變當歸根際土壤微生物的群落結構。與對照和載體處理相比，生物肥料處理的比值分別增加92.6%、39.2%，說明施用生物肥料可以顯著改變當歸根際土壤微生物的群落結構。

2.3 生物肥料對當歸根際土壤脲酶和磷酸酶活性的影響

2.3.1 對土壤脲酶活性的影響 土壤酶是表征土壤中物質、能量代謝旺盛程度和土壤質量水平的一個重要生物指標［24］。表3顯示，在當歸根際施用生物肥料能夠顯著增加土壤脲酶活性。與對照相比，生物肥料處理的脲酶活性增加46.9%，與載體處理相比增加9.09%，差異顯著。

2.3.2 對土壤磷酸酶活性的影響 磷酸酶可以加速有機磷的脫磷速度，積累的磷酸酶對土壤磷素的有效性具有重要作用［25］。表3結果表明，與對照相比，生物肥料處理土壤酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性分別增加19.9%、43%，差異顯著；與載體處理相比，分別增加9.66%、8.51%。

2.4 生物肥料對土壤微生物功能多樣性影響

2.4.1 對土壤微生物平均顏色變化率（AWCD）的影響 AWCD反映土壤微生物的整體活性［26］，可作為土壤微生物活性的有效指標［19,27］，不同施肥處理土壤的AWCD分析結果見圖1。由圖1可知，不同施肥處理土壤微生物AWCD的總體變化趨勢隨著時間延長而逐漸提高，在培養24～120 h期間，曲線斜率最大，AWCD增長率最高，表明此階段土壤微生物碳源代謝活性最高。不同處理間相比，施生物肥料處理AWCD值高于載體處理和對照，可見，施用生物肥料能提高土壤微生物代謝活性。

圖1 不同處理對土壤微生物AWCD的影響Fig. 1 Effects of different treatments on soil microganism AWCD

2.4.2 對土壤微生物群落功能多樣性指數的影響 通過計算培養120 h時的Shannon-Wiener物種豐富度指數（H'）、McIntosh物種均一度指數（U）、物種優勢度指數（D）來表征土壤微生物群落代謝功能多樣性［28-29］。表4結果表明，在當歸根際施用生物肥料后，土壤中微生物群落功能多樣性指數的變化趨勢與微生物利用單一碳源能力的趨勢基本一致，都是生物肥料處理最高，載體處理次之，對照最小。與對照相比，物種豐富度指數、均一度指數分別增加40.2%、6.6%；與載體處理相比，分別增加25.5%、1.6%；物種優勢度指數（Sinpson）不同處理間基本無影響。說明施用生物肥料可以提高當歸根際土壤微生物豐富度指數和物種均一度指數，對物種優勢度指數基本無影響。

表2 不同處理對當歸根際土壤微生物數量的影響Table 2 Effects of different treatments on number of microorganisms in rhizosphere soil of A. sinensis

表3 不同處理對當歸根際土壤酶活性的影響Table 3 Effects of different treatments on enzyme activity in rhizosphere soil of A. sinensis

表4 不同處理對當歸根際土壤生物功能多樣性指數的影響Table 4 Effects of different treatments on functional diversity indexes of rhizosphere soil of A. sinensis

2.4.3 生物肥料對單一碳源的影響 不同施肥措施對土壤微生物群落碳源利用能力產生不同影響。AWCD高低可用來表征微生物對碳源的利用率高低［26］。計算出Eco-microPlate上的31種碳源96 h的Ci-R 值平均值，對變化較大的14種碳源進行分析，表5結果顯示，施用生物肥料后可顯著提高D-木糖、葡萄糖-1-磷酸鹽、L-苯基丙氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、D，L-α-甘油、I-赤藻糖醇、N-乙酰基-D-葡萄胺7種碳源的利用率，降低了L-絲氨酸、丙酮酸甲酯、腐胺、4-羥基苯甲酸、D-半乳糖醛酸、衣康酸、D-蘋果酸7種碳源的利用率，使單一碳源的代謝發生變化。與對照相比，生物肥料處理的D-木糖、葡萄糖-1-磷酸鹽、L-苯基丙氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、D，L-α-甘油、I-赤藻糖醇、N-乙酰基-D-葡萄胺的利用率分別增加89.8%、86.8%、17.3%、14.0%、35.5%、21.7%、91.3%；碳源L-絲氨酸、丙酮酸甲酯、腐胺、4-羥基苯甲酸、D-半乳糖醛酸、衣康酸、D-蘋果酸分別降低了18.2%、10.2%、12.2%、16.0%、10.4%、5.9%、15.5%。碳源利用發生了變化，說明微生物種群發生變化，施用生物肥料改變了微生物群落結構。

表5 不同處理對單一碳源的影響Table 5 Effects of different treatments on single carbon source

3 討論

土壤微生物是土壤生態系統中的重要組成部分，是土壤中物質轉化的動力，其群落結構組成及其變化在一定程度上反映土壤質量，同時也是克服連作障礙及其他土壤障礙因子的關鍵。楊永等［30］研究表明，在哈密瓜上施用微生物肥料能改變土壤真菌的群落結構，降低根際病原真菌數量，使大量有益真菌繁衍。唐艷領［31］研究表明，在嚴重連作土壤上對辣椒施用微生物肥料能夠提高土壤中微生物數量，提高土壤酶活性，降低辣椒疫病的發生。胡麗可［32］在連作大棚中施用5406菌肥，辣椒根際土壤中細菌數量顯著增加，真菌數量減少，土壤酶脲酶、蔗糖酶、過氧化物酶活性顯著提高，也可以提高辣椒的品質。可見生物肥料可以有效減輕土壤連作障礙的發生，增加土壤微生物數量和提高酶的活性，提高作物的產量和品質。本研究在當歸上施用生物肥料后，當歸根際土壤中細菌、真菌、放線菌都顯著增加，土壤脲酶、磷酸酶活性顯著增加，與前人研究結果基本一致。通過Biolog-MicroPlate方法測定微生物對31種的利用情況，表明生物肥料改變了14種碳源的利用率，施用生物肥料可以改變土壤微生物群落結構。土壤微生物群落結構和組成的多樣性與均勻性不僅提高土壤生態系統的穩定性與和諧性，同時也提高對土壤微生態環境惡化的緩沖能力［33］。土壤中微生物數量在一定程度上影響土壤酶的活性，土壤中酶活性是土壤肥力的一個重要指標［34］。施用生物肥料可以顯著提高土壤脲酶、磷酸酶的活性。耿士均等［35］研究表明微生物菌劑和生物有機肥可顯著改善植物根周的微環境，調節菌群種類和數量，促進有益菌群的生長，土壤中微生物含量增加，可以提高各種酶活性。酶活性與上壤中各營養元素的釋放與發育土壤中腐殖質的形成以及土壤的結構和物理狀況密切相關。張輝等［36］研究表明，生物有機無機復合肥可明顯提高土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶活性，促進土壤有機質的分解轉化和速效養分釋放。本研究結果表明，施用生物肥料增加了土壤細菌和放線菌的數量，提高了微生物的活性和土壤微生物的群落結構多樣性［37］；土壤中微生物含量增加，從而提高了土壤的脲酶、磷酸酶等活性，由于酶促反應增強，加速了土壤有機質的分解和礦物質養分的轉化，有利于農作物根系對養分的吸收，從而提高當歸的產量。

4 結論

本研究結果表明，當歸專用生物肥料對當歸根的生長有顯著促進作用，施用生物肥料后當歸的蘆頭直徑和根干重顯著增加，與對照相比，分別增加了31.39%、100.5%，提高了當歸的商品性。施用生物肥料增加了土壤微生物的數量，與對照相比，細菌、真菌、放線菌分別增加154%、21.6%、34.7%，使土壤微生物功能多樣性發生變化；提高了土壤脲酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性，較對照分別增加46.9%、19.9%、43.0%。土壤中微生物數量增加，提高了土壤酶活性，加速了土壤有機質的分解和礦物質養分的轉化，有利于農作物根系對養分的吸收，從而提高當歸產量。