醫用菌株保存方法的研究
——以土壤桿菌為例

陳 璐 姚博偉 姚登明

（1、寧夏師范學院，寧夏 固原756000 2、寧夏計量質量檢驗檢測研究院，寧夏 銀川750000）

可得然膠是一種重要的食品添加劑，其產生菌株土壤桿菌（Alcaligenes faecalis）最初是由日本的原田篤也（Tokuya Harada）教授于1964 年從土壤中發現的。可得然膠由于具有加熱成膠的特性，也被稱為熱凝膠。日本Takeda 公司對可得然膠的食用安全性進行了相關的研究及評價，研究結果表明可得然膠無誘變性和致癌性，食用時不會導致某些急性慢性疾病的發生。1989年在美國、日本、韓國及中國臺灣等國家和地區開始廣泛生產和使用可得然膠，并于1996 年12 月經美國FDA 批準可得然膠可以作為增稠劑、穩定劑等直接用于食品工業中，2006 年6 月我國衛生部批準可得然膠作為食品添加劑應用于食品中。

隨著我國食品產業的快速發展，可得然膠產生菌株得到了廣泛的應用，因此該菌株的保藏是一項非常重要的工作。目前常用的菌種保藏方法有斜面瓊脂低溫保存、液體石蠟保存、真空冷凍干燥保存及液氮超低溫保存[1,2]，而真空冷凍干燥保存技術相較于其它保藏方法具有低溫、干燥及真空的優良條件，能夠有效地使細胞處于基本休眠狀態，并一定程度內抑制生長繁殖，從而降低菌種的死亡率及變異率，現已得到廣泛的應用。但是如果直接用菌液凍干保存，其存活率非常低，由于保護劑可以盡可能的保護其生物活性和生理生化特性，從而減輕冷凍干燥過程中對菌體的損害[3],因此添加不同保護劑以提高凍存效率是關鍵。

本文以實驗室保存的一株土壤桿菌714 為研究對象，采用單因素試驗及正交試驗設計，對各類保護劑進行篩選并優化出最佳的保護劑配方，從而最大程度地減少凍存對菌種產生的傷害，提高菌種的存活率，并保持良好的產可得然膠的性能，以期更好的應用于食品工業中。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與實驗設備

1.1.1 菌株

土壤桿菌（Alcaligenes faecalis）714,由華東師范大學微生物實驗室保存。

1.1.2 培養基

（1）種子培養基（g/L）：蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，pH=7.2，121 °C 滅菌20 min 備用。（2）計數培養基為種子培養基中添加2%瓊脂粉；（3）保護劑溶液配制：根據質量比配制各種保護劑溶液。

1.1.3 主要試劑與儀器

1.1.3.1 試劑：市售食品級脫脂乳粉、麥芽糊精，蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、甘油，所用試劑均為生化級，購自國藥集團化學試劑有限公司（上海）。

1.1.3.2 儀器：GNP-9160 型隔水恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；DL-CJ-2NDI 型超凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；BL-100A 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實驗設備有限公司；超低溫冰箱，遼寧瀚瓏廷生物科技有限公司；CR-21N 高速冷凍離心機，上海賽默飛生物有限公司；真空冷凍干燥機，寧波新之生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗流程: 菌種活化→離心收集菌體→生理鹽水清洗菌體→加入不同凍干保護劑→分裝安瓿管→預凍→真空冷凍干燥→凍干菌粉→復水→活菌計數→計算存活率。

1.2.2 菌種活化及菌懸液的制備

從斜面上刮取一環新鮮的菌種接入到種子培養基中，250r/min，30℃培養16h，取等量種子液于無菌離心管中，10000r/min 離心5min，棄上清，菌體用無菌生理鹽水清洗兩次，10000r/min 離心5min，用等體積不同保護劑溶液重懸菌體，制成菌懸液，取樣計數，并吸取菌懸液分裝至無菌的安瓿管中，每管300ul。

1.2.3 冷凍干燥

將分裝有菌液的安瓿管置于-80℃冰箱中預凍2h，然后迅速將徹底凍結的菌液轉移至真空冷凍干燥機中，啟動凍干程序進行抽真空干燥，冷凍干燥24h。

1.2.4 凍干前細胞總數的測定

吸取100μL 菌液用無菌水10 倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋梯度，吸取100μL 菌懸液涂布于計數培養基上，每個梯度做3 個平行，將平板放入恒溫培養箱中，30℃倒置培養，待菌落長出后，計數，根據稀釋倍數計算原菌懸液中的細胞總數。

1.2.5 凍干存活率的測定

向凍干后的各菌粉中加入等體積無菌水，充分溶解混勻后，梯度稀釋涂布計數，凍干后細胞存活率計算式如下：

凍干存活率（%）=每ml 菌懸液凍干后存活細胞數/凍干前每ml 菌懸液中的細胞總數X100%

1.2.6 單一保護劑的選擇

1.2.6.1 保護劑的篩選

菌株714 用種子培養基活化后，離心收集菌體，用各種保護劑溶液重懸菌體，真空干燥機中凍干，稀釋涂布，計算存活率。根據相關文獻報道[4-7]，本文中所選用的凍干保護劑種類及濃度如表1 中所示。

表3 正交試驗因素及水平

表1 保護劑種類及濃度

1.2.6.2 凍干保護劑濃度的優化

分別選取各類保護劑中保護效果最好的保護劑對其濃度進行優化，試驗中所選用的保護劑種類及濃度如表2 中所示。

表2 保護劑濃度

1.2.6.3 復合保護劑的選擇

根據單因素實驗的結果，從各大類保護劑中分別選出一種保護效果好的保護劑，利用正交設計軟件，采用L9(33)設計正交試驗，正交試驗設計見表3。

1.2.6.4 數據分析

用Excel2013、Graphpad prism7.0 及正交設計助手II 對結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 保護劑的篩選

選用糖類、醇類和大分子類共11 種常用的保護劑，考查在菌株714 凍干過程中的保護效果。從表4 結果可以看出，在糖類物質中，海藻糖對菌體具有較好的保護效果，其存活率為36.7%，在多元醇中，山梨醇較甘油及甘露醇保護效果好，大分子物質脫脂奶粉保存效果相對較好，綜合上述結果，選用海藻糖、山梨醇及脫脂乳粉作為凍干保護劑，進行下一步單因素試驗。

表4 不同保護劑對菌株凍存的影響

2.2 凍干保護劑濃度的優化

2.2.1 脫脂奶粉濃度優化

圖1 為脫脂奶粉濃度對菌株凍存的影響。可以看出，脫脂奶粉對菌體具有一定的保護效果，且脫脂奶粉濃度不同時存活率也有所差異。當脫脂奶粉濃度低于15%時，隨著脫脂奶粉濃度的增加，存活率逐漸增加；當脫脂奶粉濃度為15%時，存活率最高，為32.5%。當脫脂奶粉濃度大于15%時，存活率有所下降。這可能是在菌種凍存中脫脂奶粉能減少細胞暴露于氧氣和介質中的面積，同時乳清蛋白能在菌體表面形成蛋白膜，對細胞進行保護，并可固定凍干酶類，減少由于細胞壁損壞而引起的胞內物質泄漏，從而起到較好的保護作用[8]，另外，脫脂奶粉中含有的乳糖也能起到保護的作用[9]。

圖1 脫脂奶粉濃度對菌株凍存的影響

2.2.2 海藻糖濃度優化

圖2 為海藻糖濃度對菌株凍存的影響。當海藻糖濃度為4%時，保護效果最好，存活率最高為65.2%，隨著海藻糖濃度的增加，菌株存活率逐漸降低。海藻糖相較于脫脂奶粉表現出明顯的保護優勢，其凍干后最高存活率可達到脫脂奶粉的近2 倍。其原因可能是海藻糖具有較大的水化體積，能競爭更多的蛋白質水化層中的水，使蛋白質結構更為緊密，不易受到外界不利環境的影響，且在同等條件下，海藻糖顯示了最高的玻璃化相轉變溫度，表現出優越的保護效果[5]，另外由于海藻糖分子較小，容易進入蛋白質分子的空隙中，一定程度上抑制了蛋白質分子內部結構的變化，從而有效地避免了蛋白質變性失活[10]。

圖2 海藻糖濃度對菌株凍存的影響

2.2.3 山梨醇濃度優化

圖3 為山梨醇濃度對菌株凍存的影響。隨著山梨醇濃度的增加，菌株存活率也逐漸增加，當山梨醇濃度為7%時，保護效果最好，存活率最高為43.9%；當山梨醇濃度大于7%時，存活率略有下降。這可能是由于山梨醇可以和細菌的細胞膜發生相互作用，一定程度上對細胞膜起到保護作用，另外還可以和細胞中的蛋白質之間形成氫鍵，穩定了蛋白質的結構特性及相關功能特性，從而對菌體起到保護作用[11]。相關文獻報道山梨醇在乳酸菌凍存中也有較好的保護效果[12]。

圖3 山梨醇濃度對菌株凍存的影響

2.3 正交試驗優化菌種凍干保護劑

根據上述單因素試驗對保護劑的篩選，得到脫脂奶粉、山梨醇及海藻糖對菌種凍干有較好的保護效果，且最優保護劑濃度依次為10%、7%及4%。但是單一的保護劑凍干存活率相對較低，因此在單因素試驗的基礎上，進一步優化復合保護劑的效果。用正交設計軟件助手設計了三因素三水平L9(33)的正交試驗，以菌株的存活率為評價指標，結果見表5。

表5 正交實驗結果與分析

由極差R 可以判斷，對菌種凍存后存活率的影響程度依次為脫脂奶粉＞山梨醇＞海藻糖。從存活率可以看出，當組合為脫脂奶粉10%、山梨醇5%、海藻糖1%時，保護效果最好，此時存活率為87.2%，大于任一單一因素的存活率，優化效果明顯。通過表6 中的方差分析表明，脫脂奶粉的F 值大于F 臨界值，說明脫脂奶粉對菌體凍存具有顯著性的影響，因此極差分析和方差分析結果一致。

表6 顯著性分析

3 結論

試驗表明，菌種在真空冷凍干燥過程中，添加保護劑對菌體存活率有很大的影響。通過單因素試驗從糖類、多元醇類及大分子類共11 種物質中分別篩選得到海藻糖、山梨醇及脫脂奶粉對菌株凍干有較好的保護效果，且最優保護劑濃度依次為4%、7%及15%。正交試驗得到土壤桿菌存活率最高的保護劑配方為：脫脂奶粉10%、山梨醇5%、海藻糖1%，凍干后菌株的存活率可達87.2%，大于任一單一因素的存活率，優化效果明顯。極差R 顯示，對菌種凍存后存活率的影響程度依次為脫脂奶粉＞山梨醇＞海藻糖。脫脂奶粉是一種由蛋白質、乳糖、鹽類、維生素類等形成的混合物，由于凍干后的菌粉呈較輕的多孔無定性結構，容易復水[11]，使其在菌種凍存中具有廣泛的應用。脫脂奶粉單獨作為保護劑時凍干后的存活率較低，一般都是與其他保護劑復配來提高菌種凍干存活率[13]。本文也通過脫脂奶粉與其他保護劑的復配得到了保護效果良好的配方，為可得然膠產生菌株的保藏及工業化生產具有積極的作用。