脂肪組織凍存的方法研究

夏潔芳　徐峰波　李雁冰　田雨　王戰濤　張建中

摘要：自體脂肪組織因具有來源豐富、易于取材、操作簡單，無排異反應等優點，使得自體脂肪移植成為醫療美容行業進行面部凹陷填充、豐胸豐臀等整形手術時較為流行的技術。手術為達到較高的移植存活率和整形效果，需要對患者進行多次的脂肪抽吸并重復移植，過程較長，增加患者痛苦。因此，一次性抽吸足夠量的脂肪組織進行凍存，再次移植時復蘇使用便成為了解決這一問題的最優方法。本文現就脂肪組織的采集、取脂純化方法、凍存保護劑的選擇、凍存復蘇方法及提高移植存活率研究做一綜述。

關鍵詞：脂肪組織;取脂方法;凍存保護劑;凍融;移植成活率

中圖分類號：R622+.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.14.009

文章編號：1006-1959（2020）14-0024-03

Study on the Method of Cryopreservation of Adipose Tissue

XIA Jie-fang1，XU Feng-bo2，LI Yan-bing1，TIAN Yu1，WANG Zhan-tao1，ZHANG Jian-zhong3

（1.Shaanxi Stem Cell Engineering Co.，Ltd.，Xi'an 710000，Shaanxi，China;

2.Yinfeng Bioengineering Group Co.，Ltd.，Jinan 250000，Shandong，China;

3.Department of Endocrinology，China-Japan Lianyi Hospital of Jilin University，Changchun 130033， Jilin，China）

Abstract：Autologous fat tissue has the advantages of abundant sources， easy access to materials， simple operation， and no rejection reaction. Autologous fat transplantation has become a popular technique for plastic surgery in the medical and cosmetic industry for facial depression filling， breast enlargement and hip buttocks. In order to achieve a high transplant survival rate and plastic effect， it is necessary to perform multiple liposuctions and repeat transplantation on the patient. The process is longer and increases the patient's pain. Therefore， suctioning a sufficient amount of adipose tissue for cryopreservation at a time， and resuscitating it for transplantation again become the best way to solve this problem. This article will review the research on the collection of adipose tissue， the method of purifying fat， the choice of cryoprotectant， the method of cryopreservation and resuscitation， and the improvement of transplant survival rate.

Key words：Adipose tissue;Fat removal method;Cryopreservation agent;Freeze-thaw;Transplant survival rate

自體脂肪抽吸物是理想的填充材料，注射自體脂肪以矯正軟組織缺損或增大體積是整形手術常見的方法。脂肪抽吸物作為填充材料優點很多，如數量多、易獲得、便宜且與宿主相容，還可對脂肪供體部位起輪廓修飾作用，但自體脂肪移植因其存活率較低，臨床應用中常采取連續多次移植以獲得最佳效果，導致高花費，同時增加脂肪組織供體部位的發病率及患者的不適。目前，脂肪抽吸只能在與脂肪形成術相同的條件下進行即刻自體脂肪移植，因此剩余的從手術中獲得的脂肪通常被丟棄。隨著更多的軟組織增強應用于整形手術，對儲存已經收獲的脂肪組織以備將來使用或重復使用的需求越來越多。本文將從脂肪組織的采集、取脂純化方法、凍存保護劑的選擇、凍存復蘇方法及提高移植存活率方法方面，對脂肪組織體外深低溫儲存研究進展作一綜述。

1脂肪組織的采集

目前臨床常用的取脂方法主要有3種：①切開取脂法：切開皮膚，按使用量切取脂肪組織，用剪刀剪成顆粒狀，縫合皮膚。此法脂肪細胞損傷較小，但切口會產生瘢痕，一般選擇腹部取脂，因此取脂量有限;②注射器吸脂法：將大量腫脹液注射于皮下，用16～22號針頭接10～20 ml注射器，進行脂肪抽吸。此法取脂量小，醫務人員工作量大，但脂肪細胞損傷小，適用于小部位少量取脂;③負壓吸脂法：在吸脂部位切開約0.5～1 cm切口，用剪刀在皮下脂肪層稍加分離，利用吸脂針、吸引頭、無菌負壓吸引瓶及負壓吸引器串連設備，對手術部位脂肪層進行拉鋸式刮吸。現臨床上使用的吸脂方法包含超聲吸脂、共振吸脂及水動力吸脂。張倩等[1]研究了水動力吸脂法與負壓吸脂法的吸脂時間及移植成活率，隨訪發現術后1年水動力吸脂法脂肪成活率大于負壓吸脂法，且吸脂時間水動力組低于負壓吸脂組。張新合等[2]研究發現，不同取脂方法對細胞的損傷程度不同：剪刀剪碎法<注射器法<吸管法;當壓力>-50 kPa時，隨著壓力的增大，脂肪細胞損傷程度增加。趙廷峰等[3]比較了注射器吸脂法及負壓吸脂法，認為兩種方法吸取的脂肪經靜置后，完整脂肪細胞計數無顯著差異，細胞壁也較完整。也有研究認為[4]，對于脂肪組織凍存，注射器吸脂法獲得的脂肪細胞存活率相對較高，是較為理想的脂肪組織獲取方式。上述研究結果看似矛盾，實際與吸脂方法所采用的吸引頭直徑、吸力壓強等因素有關系，因此，如何選取脂肪組織凍存及采樣方法環節有待進一步研究，以篩選出對脂肪細胞破壞率最小的方法。同時脂肪獲取部位對脂肪顆粒移植吸收率也存在影響，李燕等[5]研究不同取脂部位自體脂肪顆粒移植吸收率發現，大腿及腰部的自體脂肪移植吸收率低于腹部，但取脂部位也因患者而異，因此進行組織凍存時，取脂部位的選擇是否對凍存效果有影響，也有待進一步研究。

2純化脂肪顆粒的方法

為了去除脂肪抽吸物中的雜質，得到較為均一的脂肪顆粒，需要進行脂肪純化。脂肪顆粒的純化方法：①靜置法：將脂肪抽吸物靜置，待分層后，去除上層脂滴和下層腫脹液等混合液體，得到中間層脂肪層;②離心法：將抽吸物離心后，得到分為上、中、下三層的樣本，取中間層;③棉墊過濾法：用醫用脫脂紗布及脫脂棉制成棉墊，將抽吸物傾倒于無菌棉墊上，棉墊會吸附抽吸物中的液體及油滴，得到脂肪組織;④撈取法：將抽吸物置于無菌容器中，混以生理鹽水，撈取漂浮的脂肪組織。多數研究認為脂肪純化效果越好，移植后脂肪組織的存留率越高，這可能歸因于純化脂肪組織中脂肪來源間充質干細胞的數量最大化。從純化效率方面比較，離心法優于靜置法以及棉墊過濾法;而棉墊過濾法獲得的活性脂肪細胞數高于離心法，且棉毛巾過濾得到的脂肪組織內，血管基質組分（SVF）的數目均高于離心法[6]，且隨著離心速率的增加，離心法對脂肪組織的損傷力度會增加[7]，脂肪細胞的代謝活性也會降低[8]。也有研究認為，棉墊法純化效果優于離心法，靜置沉淀法效果最差[9]，但其是從幾種方法去除水分和油脂效率、對移植物活性的影響方面對純化效率進行分析的。因此，不同方法分析得出的結果也不同。目前臨床上應用較多的是離心法及棉墊過濾法，關于脂肪組織凍存最佳取脂方法仍無臨床統一標準。

3凍存保護劑的選擇

在細胞凍存過程中，溫度快速下降導致胞內冰晶形成，從而損傷細胞，溫度下降速率越高，胞內冰晶形成越多;而溫度下降速率慢則導致細胞外溶質濃度升高，造成細胞損傷。

凍存保護劑根據其是否穿透細胞膜可分為滲透性和非滲透性2類。滲透性冷凍保護劑可以滲透到細胞內，易與溶液中的水分子結合，一般是一些小分子物質，如甘油、DMSO、乙二醇、乙酰胺、甲醇等;相反，非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是大分子物質，如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡萄糖、白蛋白、羥乙基淀粉等。凍存時，在冰晶形成之前，非滲透性凍存保護劑優先結合溶液中水分子，降低細胞外溶液的電解質濃度，減少陽離子進入細胞的數量，從而達到保護細胞的作用。

研究發現[10]，不使用凍存保護劑時，脂肪組織在-80 ℃下凍存3個月，其形態學觀察結果優于-20 ℃和-196 ℃，且移植吸收率及纖維化情況相對較低。但魏國茜[11]使用60%小牛血清+15%DMSO+25%DMEM作為凍存保護劑時，-196 ℃凍存溫度優于-80 ℃及-20 ℃，且-196 ℃下可以凍存6個月甚至更長時間，-80 ℃凍存6個月時脂肪細胞活性不及凍存3個月，僅適用于短期保存。孫音等[12]研究發現，人大腿內側脂肪組織凍存6個月后復蘇移植，60%小牛血清+15%DMSO+25%DMEM組脂肪活性高于30%胎牛血清+15%DMSO+55%DMEM組。程愛娟[13]采用與正常乳房脂肪等體積的生理鹽水和海藻糖作為凍存保護劑，在-196 ℃凍存2周后復蘇解凍，發現低溫條件下，與生理鹽水相比海藻糖能較好保持脂肪細胞活性。黃楨雅等[14]采用分段降溫法，在不使用凍存保護劑條件下，在-80 ℃將脂肪組織凍存不同時間，發現隨著凍存時間的延長，脂肪組織的結構及生物學活性逐漸下降，不建議臨床移植不添加保護劑直接凍存的脂肪組織。對于脂肪組織凍存保護劑的選擇，目前沒有公認的保護劑配比標準，各類研究相對較多，且選擇不同儲存溫度時，不同的凍存保護劑使用效果不同。可見，選擇何種凍存保護劑進行脂肪組織凍存，在何種儲存條件下如何配比，還需繼續探索。

4凍存及復蘇方法

細胞凍存方法主要有玻璃化法（即快速凍存法）和超低溫慢速凍存法。玻璃化法凍存液的配制步驟繁瑣，且高濃度凍存液對細胞存在毒性，因而超低溫慢速凍存法變得更為常用。超低溫慢速凍存主要有兩種降溫程序：①程序降溫法：利用程序降溫盒設定程序由室溫降低至-70 ℃后再放置到液氮中進行長期保存;或利用程序降溫儀設定程序降溫至-196 ℃，然后轉移至液氮中長期保存;②分段降溫法：利用凍存管處于4 ℃、-20 ℃、-80 ℃保存。常規分段降溫的缺點是耗時較長，而程序降溫費用昂貴、操作復雜、對設備要求高。復蘇方法基本均認可37 ℃水浴震蕩快速復溫。多篇文獻中均有提及引用Pu及其同事的研究[15]，以1～2 ℃/min速率從22 ℃降至-30 ℃，再將脂肪組織轉移至液氮中長期保存，復蘇時使用37 ℃水浴快速溶解，其各項結果均較好。Mashiko T等[16]將脂肪組織簡單冷卻保存至-80 ℃或采用程序降溫法保存至-196 ℃，37 ℃快速復溫后發現冷凍脂肪組織較新鮮組織而言，多數脂肪細胞壞死，且基質血管細胞數目顯著下降，移植至免疫缺陷裸鼠體內后，冷凍保存的脂肪多數被保留為壞死組織或纖維組織。目前對脂肪組織凍存方法的研究繁多，結果也不同，甚至相悖，該如何選擇應不斷篩選、論證。

5脂肪移植成活率及安全性問題

自體脂肪移植獲得長期良好組織填充效果的一個主要障礙是移植部位注射脂肪吸收率高，達其體積的70%，隨著時間的推移，移植物中的一些壞死物質和血運重建不足可能是造成這一問題的原因。因此提高脂肪移植成活率也是一個重要的臨床問題。關于提高脂肪組織移植成活率的研究多集中于移植過程中盡量減少創傷，優化組織生存能力，加強血運重建等。有研究利用富血小板血漿（PRP）聯合脂肪組織共同移植，結果表明PRP可促進脂肪組織存活及血管形成[17]。董政等[18]利用高壓氧處理脂肪組織移植后大鼠，發現脂肪組織周圍的微血管數量明顯增加，促進了脂肪細胞增殖，進而提高脂肪成活率。脂肪組織的移植部位也會影響其存活率，移植至脂肪較少部位時脂肪組織存活率低[19]。研究顯示[20]，冷凍脂肪組織移植比新鮮脂肪在手術部位引起的腫脹和變色少。Ko MS等[21]將來自同一供體的人脂肪間充質干細胞與低溫保存的脂肪組織混合移植，發現脂肪組織移植存活率有提高。目前，脂肪組織移植并無標準方法或最優方法來提高移植存活率，深低溫保存后脂肪組織移植的存活率研究也較少，有待深入研究。

在自體脂肪移植時，除考慮成活率問題外，安全性問題也是臨床應用中極為重視的。任姝錦等[22]追蹤統計了82例接受自體脂肪顆粒移植治療面部凹陷的患者，部分患者雖在術后出現血腫或不同程度的硬結節，但后期均逐漸恢復，預后良好，患者滿意度達97%。蔡磊等[23]分析了450例患者應用自體脂肪移植進行面部輪廓重塑及年輕化術后效果及安全性，其中132例患者術后皮膚出現局部淤青，但2周后均逐步消退，無嚴重并發癥。自體脂肪移植術后輕微并發癥如纖維化、鈣化、感染等均預后較好。但嚴重并發癥如脂肪移植物導致血管栓塞、失明等目前仍無有效治療措施，也無充分證據證明脂肪移植術可增加患者患腫瘤的風險。因此脂肪移植的安全性還需通過大量臨床研究總結經驗。

6總結

脂肪組織體外凍存研究目前已有大量成果，但整個凍存方案如脂肪組織的采集方法、部位的選擇、純化脂肪顆粒方法的確定、凍存保護劑的選擇及配比、凍融程序、使用前質量標準等方面均無公認統一的標準。脂肪組織凍存的目的是方便使用，但凍存后移植存活率受收集處理脂肪的方法、組織接觸血液或利多卡因藥物、供受體位置、離心注射方法等多種因素影響，因此其相關研究結果也各式各樣。在脂肪組織凍存各環節選擇何種條件以組成最優化的標準方案，仍需繼續探索以及更多的臨床研究。脂肪組織凍存后移植的成活率問題及安全性問題也需要通過大量臨床研究來探究。這些問題的解決可能推動脂肪組織移植乃至再生醫學及組織工程的前進發展。

參考文獻：

[1]張倩，時杰，李曉殿，等.兩種吸脂方法在自體脂肪移植隆乳術的應用及效果[J].中華醫學美學美容雜志，2019，25（1）：25-28.

[2]張新合，高建華.取脂方法及吸脂壓力對脂肪細胞損傷程度的實驗研究[J].中華醫學美學美容雜志，2001，7（5）：254-257.

[3]趙延峰，董稚明，董宏華，等.不同取材及處理方法對脂肪細胞影響的研究[J].中國美容醫學，2014（22）：46-49.

[4]Cheriyan T，Kao HK，Qiao X，et al.Low Harvest Pressure Enhances Autologous Fat Graft Viability[J].Plast Reconstr Surg，2014，133（6）：1365-1368.

[5]李燕，郭莉，謝淼，等.不同取脂部位自體脂肪顆粒移植吸收率的臨床研究[J].河北醫藥，2017，39（1）：51-53.

[6]Pfaff M，Wu W，Zellner E，et al.Processing Technique for Lipofilling Influences Adipose-Derived Stem Cell Concentration and Cell Viability in Lipoaspirate[J].Aesthetic Plastic Surgery，2014，38（1）：224-229.

[7]Ni Y，He X，Yuan Z，et al.Effect of Fat Particle-to-SVF Ratio on Graft Survival Rates in Rabbits[J].Annals of Plastic Surgery，2015，74（5）：609-614.

[8]吳榮薇，陸海濱，楊曉楠，等.不同純化方法在脂肪體積保持方面的實驗研究[J].中華整形外科雜志，2018（2）：141-145.

[9]陸海濱.不同方法純化顆粒脂肪的效果評價及其對移植后轉歸的影響[D].中國醫學科學院北京協和醫學院，2017.

[10]Zheng W，Shen J，Wang H，et al.Effects of Frozen Stromal Vascular Fraction on the Survival of Cryopreserved Fat Tissue[J].Aesthetic Plastic Surgery，2019，43（3）：826-835.

[11]魏國茜.不同凍存條件對人顆粒脂肪活性影響的實驗研究[D].大連醫科大學，2017.

[12]孫音，伍明政，顧洛莎，等.不同配比低溫保護劑對凍存人顆粒脂肪裸鼠移植的影響[J].中國醫藥導報，2019，16（5）：19-22.

[13]程愛娟，陳文，王少華.海藻糖對顆粒脂肪細胞冷凍保存效果的影響[J].徐州醫學院學報，2013，33（10）：692-694.

[14]黃楨雅，陳俊男，賴琳英，等.不同凍存時間對脂肪組織生物學活性的影響[J].中國美容醫學，2019，28（2）：14-17.

[15]Pu LL.Cryopreservation of adipose tissue[J].Organogenesis，2009，5（3）：138-142.

[16]Mashiko T，Wu SH，Kanayama K，et al.Biological Properties and Therapeutic Value of Cryopreserved Fat Tissue[J].Plastic and Reconstructive Surgery，2018，141（1）：104-115.

[17]Lei X，Liu H，Pang M，et al.Effects of Platelet-Rich Plasma on Fat and Nanofat Survival：An Experimental Study on Mice[J].Aesthetic Plastic Surgery，2019（43）：1085-1094.

[18]董政，任紀禎，李坤，等.高壓氧促進自體脂肪移植成活率的實驗研究[J].中國美容整形外科雜志，2019，30（6）：336-337，355.

[19]Yu P，Yang X，Qi Z.Influence of Recipient Site on the Function and Survival of Fat Grafts[J].Annals of Plastic Surgery，2019（83）：241.

[20]Shu Z，Gao D，Pu LLQ.Update on Cryopreservation of Adipose Tissue and Adipose-derived Stem Cells[J].Clinics in Plastic Surgery，2015，42（2）：209-218.

[21]Ko MS，Jung JY，Shin IS，et al.Effects of Expanded Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells on the Viability of Cryopreserved Fat Grafts in the Nude Mouse[J].Int J Med Sci，2011，8（3）：231-238.

[22]任姝錦，劉玉麗，李正斌.自體脂肪顆粒移植在面部凹陷整形美容中的應用研究[J].中國醫療美容，2019（7）：31-34.

[23]蔡磊，楊明霞，商婷，等.450例應用自體脂肪移植進行面部輪廓重塑及年輕化的臨床報告[J].中華整形外科雜志，2019，35（8）：748-752.

收稿日期：2020-03-19;修回日期：2020-05-06

編輯/宋偉

基金項目：吉林省科技發展計劃項目（編號：20180201029YY）

作者簡介：夏潔芳（1988.9-），女，寧夏平羅人，碩士，工程師，主要從事干細胞相關技術研究

通訊作者：徐峰波（1980.10-），男，山東菏澤人，碩士，高級工程師，主要從事干細胞、人體組織深低溫保存、細胞治療產品開發與應用研究