國內人乳頭瘤病毒檢測技術在不同實驗室間的重復性評價研究△

薛鵬，沈潔，韓歷麗#，江宇，陳汶，喬友林

1中國醫學科學院北京協和醫學院公共衛生學院，北京 100730

2國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院流行病學研究室，北京 100021

3首都醫科大學附屬北京婦產醫院北京婦幼保健院婦女保健科，北京 100026

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，嚴重威脅女性的生命健康。隨著高危型人乳頭瘤病毒（high riskhuman papillomavirus，HR-HPV）和宮頸癌病因關系的建立，針對HR-HPV的檢測已成為宮頸癌篩查的主要手段[1-2]。由于人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）檢測技術具有較高的靈敏度和陰性預測值，現已被一些國家作為初篩方法納入國家宮頸癌篩查體系[3-5]。2015年，中國國家食品藥品監督管理總局（China Food and Drug Administration，CFDA）進一步規范了HPV檢測試劑盒的臨床功能驗證[6]。盡管中國部分HPV試劑已通過嚴格的臨床性能評價[7]，表現出較高的靈敏度和特異度，但尚缺乏國產HPV試劑在不同實驗室間的重復性評價研究，難以保證其HPV檢測結果的真實可靠，在一定程度上限制了其作為宮頸癌初篩方法的推廣和應用。本研究初步評價國內兩種實時熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）方法在不同實驗室間檢測HPV的可重復性，以確保其HPV檢測結果的可靠性，旨在為中國HPV檢測技術的發展提供數據依據，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2016年11月至2017年5月于中國醫學科學院腫瘤醫院和北京大學第一醫院接受宮頸癌篩查或門診就診的210例患者，年齡為23～65歲，平均（40.2±6.3）歲，無妊娠可疑征兆，無子宮或宮頸外科手術史。本研究經中國醫學科學院腫瘤醫院倫理委員會批準，所有患者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 標本收集和處理

各醫院婦科醫師應用宮頸細胞采樣刷收集宮頸脫落細胞標本，并轉移至細胞保存液PreservCyt中保存，嚴格遵守無菌操作原則進行分樣，分別低溫保存并運送至北京洛奇臨床檢驗所實驗室和愛普益醫學檢驗中心實驗室進行透景HPV檢測，以及運送至北京凱普醫學檢驗所和朝陽區婦幼保健院實驗室進行凱普HPV檢測。

1.3 透景HPV 檢測

收集1 ml經PreservCyt提取純化后的DNA 5.0 μl，加入含有 20 μl反應液的 PCR 管中，置于ABI7500熒光PCR儀上。設置參數：95℃10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，共循環46次，單點熒光檢測在60℃，PCR反應體系的體積為25 μl。采用ABI7500熒光PCR儀的3種熒光通道（VIC、ROX、FAM）分別檢測HPV16、18和其他12種HRHPV（HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）。當VIC、ROX、FAM熒光通道的Ct值≤30且增長曲線呈光滑型起跳時，則判定為陽性；當Ct值＞30時，則判定為陰性。

1.4 凱普HPV 檢測

取純化后的 DNA 2.0 μl，加入含有 18 μl反應液的PCR管中，置于全自動定量PCR熒光儀上。設置參數：95 ℃ 10 min；95℃ 10 s，60 ℃ 60 s，38℃5 s，共循環47次，單點熒光檢測在60℃，PCR反應體系的體積為20 μl。3種熒光通道（FAM、HEX、ROX）可分別檢測HPV16、18和其他12 種 HR-HPV（HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）。當FAM、HEX、ROX 熒光通道的Ct值≤40時，則判定為陽性；當Ct值＞40時，則判定為陰性。

1.5 統計學分析

采用SAS 9.4軟件對數據進行統計分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kappa檢驗評價不同實驗室檢測技術的可重復性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同實驗室間透景HPV 檢測結果的比較

透景HPV試劑在不同實驗室間檢測HR-HPV的總一致率為99.52%（95%CI：97.35%～99.92%），Kappa值為 0.99（95%CI：0.97～1.00）；檢測 HPV16和HPV18的總一致率分別為99.52%（97.35%～99.92%）和 100%，Kappa值分別為 0.99（95%CI：0.97～1.00）和1.00；檢測其他12種HR-HPV的總一致率為99.52%（95%CI：97.35%～99.92%），Kappa值為0.99（95%CI：0.97～1.00）。（表1）

2.2 不同實驗室間凱普HPV 檢測結果的比較

凱普HPV試劑在不同實驗室間檢測HR-HPV的總一致率為99.05%（95%CI：96.59%～99.74%），Kappa 值為 0.98（95%CI：0.96～1.00）；檢測 HPV16和HPV18的總一致率分別為98.57%（95%CI：95.88%～99.51%）和100%，Kappa值為0.97（95%CI：0.93～1.00）和1.00；檢測其他12種HR-HPV的總一致率為98.57%（95%CI：95.88%～99.51%），Kappa值為0.97（95%CI：0.93～1.00）。（表2）

2.3 兩種檢測技術在不同實驗室間檢測HPV的不一致結果

對不一致的HPV檢測結果進行分析，透景試劑檢測HPV16有1例不一致樣本，Ct值為26.79，檢測其他HR-HPV有1例不一致樣本，Ct值為25.47。凱普試劑檢測HPV16有3例不一致樣本，Ct值分別為28.96、25.96和34.57，檢測其他HRHPV有3例不一致樣本，Ct值分別為36.58、33.69和39.33。兩種試劑檢測HPV18均未發現不一致。（表 3）

3 討論

目前，宮頸癌篩查存在多種策略，主要檢測技術包括HPV DNA和薄層液基細胞學[8]。由于細胞學檢查主觀性強，可重復性差，需要經驗豐富的細胞學醫師和專業設備，同時國內細胞學相關技術人員稀缺，難以建立行之有效的宮頸癌篩查體系[9]?；谥袊膰榧皩m頸癌篩查現狀，采用HPV DNA檢測作為宮頸癌的初篩方法更具篩查效能，中國政府已將HPV檢測技術納入國家“兩癌”篩查項目中，而HPV檢測方法的準確性是決定宮頸癌篩查質量的關鍵[8,10]。國際上針對HPV試劑能否應用于宮頸癌篩查有具體規定，新研發的HPV檢測試劑的靈敏度和特異度不能劣于參照標準HC2或GP5+/GP6+PCR，此外，其實驗室內和實驗室間重復性的較低置信區間界限不低于87%，同時保持Kappa值大于或等于0.5[11]。美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準上市的HPV檢測試劑包括HC2、Cervista HPV、Cobas HPV、Aptima HPV和BD Onclarity HPV，均經過上述嚴格的評價過程，表現出理想的臨床性能和實驗室內、實驗室間的重復性[12-13]。但考慮其檢測試劑和儀器設備造價昂貴，推廣至中國宮頸癌篩查體系中受到限制。近年來，國產HPV檢測試劑飛速發展，由CFDA批準的HPV檢測試劑多達60余種[14]。中國一項研究針對國內市場上不同平臺的HPV試劑進行了系統性臨床性能評價，結果表明，84.2%（16/19）的實驗室及HPV試劑的臨床靈敏度均達到了90%以上，特異度為89.1%～65.94%，其中實時熒光PCR方法的臨床性能最佳[15]，但尚不明確其HPV檢測結果是否真正準確及可靠。

表1 不同實驗室間透景HPV檢測結果的比較（n=210）

表2 不同實驗室間凱普HPV檢測結果的比較（n=210）

表3 兩種檢測技術在不同實驗室間檢測HPV的不一致結果

本研究初步評價了國內兩種實時熒光PCR方法在不同實驗室間檢測HPV的可靠性。透景和凱普試劑檢測HR-HPV、HPV16、HPV18以及其他HR-HPV在不同實驗室間的重復性均超過98%，甚至兩種方法檢測HPV18的重復性均達到了100%，表明中國透景和凱普HPV試劑的檢測結果穩定可靠，但仍有低于2%的樣本不一致。本研究結果顯示，不一致的樣本中有71.4%（5/7）Ct值較高，接近這兩種檢測方法設定的cut-off值，表明有較低水平的HPV載量，即HPV弱陽性。比利時的一項研究評估了Xpert HPV檢測技術在不同實驗室間的重復性，結果證實大部分不一致樣本的Ct值均接近其檢測方法的cut-off值[16]。挪威的一項研究也證實了這一結果[17]。本研究認為HPV檢測技術在不同實驗室間的微小差異主要來自HPV弱陽性結果。雖然HPV弱陽性結果在篩查中的發生率并不高，但僅憑單次HPV檢測結果將弱陽性結果判定為陽性是不嚴謹的做法[18]。因此，建議對HPV檢測中出現的弱陽性結果予以重視，可考慮對其重新取樣或進行重復性檢測，使用更為精準的檢測手段予以證實，避免漏診和誤診，以保證宮頸癌篩查質量。

綜上所述，透景HPV和凱普HPV檢測方法在不同實驗室間檢測HPV的重復性和Kappa值遠超過國際法規所要求的一致率≥87%，Kappa≥0.5，是可靠的HPV檢測技術，在未來可能用于宮頸癌篩查。但本研究樣本量較少，結果可能存在一定的偏倚。因此，為準確評價兩種實時熒光PCR方法在不同實驗室間檢測HPV的可靠性，尚需要在大規模篩查中進一步驗證，以提供更為可靠的證據。