趨化因子受體 7沉默對人腎癌細胞增殖、侵襲及凋亡的影響

呂棟，滕志剛，周云飛，陳芙蓉

開封市中心醫院1泌尿外科，2病理科，河南 開封4750000

腎細胞癌又稱腎癌，是中國常見的泌尿生殖系統惡性腫瘤，男性患者比例多于女性，且發病率隨著年齡的增長而升高。腎癌的發病隱匿且緩慢，約1/3的患者一經確診就已處于腎癌細胞轉移期[1]。在臨床治療中，由于腎癌細胞對化療藥物不敏感，因此，手術治療是目前臨床最有效的治療方案。有研究發現，發生腎癌細胞轉移的術后患者的預后差，5年生存率低，僅約9%[2-3]。隨著基因工程技術的不斷發展，腫瘤基因靶向治療成為臨床研究領域的焦點。趨化因子受體7（CXC chemokine re-ceptor 7，CXCR7）是近年來發現的CXC型趨化因子配體12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）的新受體，在多種腫瘤的細胞系中呈高表達[4]，參與介導細胞的增殖、凋亡及侵襲等[5-6]。但是，關于CXCR7在腎癌發生、發展中作用的研究少有報道。本研究旨在探討CXCR7對人腎癌細胞增殖、侵襲及凋亡的影響，為腎癌的個體化治療尋求靶點，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

腎癌組織樣本來源于醫院腫瘤科，健康腎組織樣本來源于腎移植科的組織活檢樣本。人腎癌細胞系A498、786-O、ACHN均購自美國模式培養物集存庫（American type culture collection，ATCC），RPMI-1640培養基、噻唑藍（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）、二 甲 基 亞 砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、雙抗（青霉素和鏈霉素）、嘌呤霉素等均購于上海生工生物股份有限公司，胎牛血清、膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）試劑盒均購自杭州四季青生物工程材料有限公司，CXCR7、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bax、cleaved-caspase-3、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2、MMP9、β-actin等一抗蛋白及蛋白抑制劑，HRP羊抗兔免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）和HRP羊抗鼠IgG二抗蛋白均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；細胞裂解液、電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）試劑均購自北京索萊寶科技有限公司，CXCR7陰性對照病毒（CXCR7-NC）、CXCR7靶向shRNA均購自上海吉瑪制藥技術有限公司，其他試劑及耗材均購自上海生工生物股份有限公司。二氧化碳（carbon dioxide，CO2）培養箱購自日本SANYO公司，DNM-9606酶標分析儀購自北京朗普新技術有限公司，濕轉儀購自美國AB公司，FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司，凝膠成像系統購自以色列DNR公司，電泳儀購自美國BIO-RAD公司，其他儀器購自德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人腎癌細胞系A498、786-O、ACHN均培養于含10%（v/v）胎牛血清和雙抗（100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素）的RPMI-1640培養基，CO2濃度為5%，培養于37℃恒溫、恒濕的細胞培養箱中。細胞復蘇后培養三代后進行后續實驗。

1.2.2 CXCR 7蛋白表達分析 收集處于對數生長期的腎癌細胞1×106個，提取總蛋白，采用酶標儀于490 nm波長條件下進行蛋白定量。采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，采用濕轉法將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，于4℃條件下依次加入封閉液孵育2 h，CXCR7一抗孵育過夜（稀釋比例均為1∶1000），二抗孵育2 h（稀釋比例均為1∶5000）。以βactin為內參蛋白，采用ECL試劑顯色，通過凝膠成像系統分析蛋白條帶。篩選CXCR7蛋白高表達的細胞系用于后續實驗。

1.2.3 慢病毒轉染 取處于對數生長期的CXCR7高表達的細胞，調整細胞濃度為1×105/ml，每孔2 ml接種于6孔板，37℃、5%CO2條件下，待細胞生長覆蓋度達到50%時進行慢病毒感染，按照試劑操作說明書步驟進行慢病毒轉染操作，sh-NC組加入20 μl CXCR7陰性對照病毒（滴度為2×108TU/ml）、sh-CXCR7組加入6 μl CXCR7干擾病毒（滴度為9×108TU/ml）以及 2 μl的 polybrene（5 μg/μl），轉染過夜后（約16 h）每天更換新鮮培養基。培養5 d后向培養基中加入終濃度為2 μg/ml的嘌呤霉素進行耐藥細胞株的篩選；對照組加入20 μl培養基，Western blot鑒定病毒轉染效果，將轉染成功的細胞用于后續實驗。

1.2.4 細胞生長曲線測定 取處于對數生長期的sh-NC組、sh-CXCR7組和對照組細胞，調整細胞濃度為1×105/ml，每孔200 μl接種于96孔板，37 ℃、5%CO2條件下連續培養，接種當天按0天計算，每24小時檢測細胞生長狀態，設置5個復孔。按WST-8試劑盒說明，于待測孔加入10 μlCCK8試劑，繼續培養3 h，采用酶標儀于450 nm波長下測定光密度（optical density，OD）值，以WST比色值為縱坐標，繪制細胞96 h的生長曲線。實驗重復3次。

1.2.5 侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 取5μg纖連蛋白，采用移液器將其均勻涂抹于Transwell小室內的PVPF聚碳酸濾膜外表面，采用同樣的操作方式涂抹5 μg的matrigel于膜內側表面。調整細胞濃度，每室分別接種2×105個sh-NC組、sh-CXCR7組和對照組細胞，設置3個復孔；37℃、5%CO2溫箱中培養4 h。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，并去除小室內側matrigel基質膠和細胞，用多聚甲醛進行固定；400倍顯微視野下隨機選取10個視野，于倒置顯微鏡下采用雙盲計數法統計膜下表面的細胞數目平均值。實驗重復3次。

1.2.6 劃痕遷移實驗檢測細胞遷移能力 將劃痕實驗插件置于24孔板，取處于對數生長期的目的轉染細胞及對照細胞，調整細胞個數為5×105個，37℃、5%CO2條件下培養過夜（約16 h）。小心移去劃痕實驗插件，用完全培養基潤洗3次，加入10 μmol/L絲裂霉素，繼續培養2 h，更換新鮮完全培養基，顯微鏡下拍照，時間點為0時，繼續培養24 h后拍照分析細胞的遷移情況。實驗重復3次。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 取處于對數生長期的細胞，調整細胞濃度為2.5×105/ml，以每孔2.5 ml接種于6孔板，37℃、5%CO2條件下過夜培養，次日用無血清培養基誘導24 h。離心收集細胞于流式上樣管，按照Annexin V-FITC試劑盒說明書向每管中依次加入150 μl Annexin V-FITC結合液，使用3 μl Annexin V-FITC和2 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液重懸細胞，室溫暗室孵育15 min。加PBS至500 μl混勻過300目篩子，30 min內上機檢測，Cell Quest軟件檢測并分析細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.8 Western blot法檢測蛋白表達情況 取處于對數生長期的細胞，調整細胞濃度為2.5×105/ml，每孔2.5 ml接種于6孔板，37℃、5%CO2條件下過夜培養，次日用無血清培養基誘導24 h。將細胞收集于1.5 ml離心管，Western blot法提取細胞蛋白，分析沉默CXCR7蛋白的表達對細胞Bcl-2、Bax、cleavedcaspase-3、VEGF、MMP2、MMP9蛋白表達的影響，以β-actin為內參，應用Image J圖像分析軟件對目的條帶的表達量進行定量分析。實驗重復3次。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析（one-way ANOVA），當組間比較差異有統計學意義時，進一步采用SNK-q法進行兩兩比較；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CXCR 7蛋白在腎癌中的表達情況

CXCR7蛋白在腎癌組織中的表達水平為（2.27±0.33），高于健康腎組織的（0.92±0.07），差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1）。Western blot檢測結果顯示，CXCR7蛋白在A498、786-O、ACHN細胞中均有表達，在786-O細胞中的表達水平相對較高（圖2），選擇其用于后續研究CXCR7蛋白對腎癌細胞的影響。

圖1 CXCR 7蛋白在腎癌和健康腎組織中的表達情況

圖2 CXCR 7蛋白在786-O、 A498、ACHN細胞中的表達情況

2.2 慢病毒轉染對786-O腎癌細胞中CXCR 7蛋白表達的影響

sh-CXCR7組786-O細胞中CXCR7蛋白的表達水平為（0.47±0.07），對照組786-O細胞中CXCR7蛋白的表達水平為（2.25±0.17），sh-NC組786-O細胞中CXCR7蛋白的表達水平為（2.19±0.15）。sh-CXCR7組786-O細胞中CXCR7蛋白的表達水平低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；sh-NC組與對照組786-O細胞中CXCR7蛋白的表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（圖3）

圖3 慢病毒轉染對786-O腎癌細胞中CXCR 7蛋白表達的影響

2.3 CXCR 7沉默對腎癌細胞增殖的影響

WST-8法分析結果顯示，慢病毒轉染沉默786-O細胞中CXCR7蛋白的表達后，sh-CXCR7組786-O細胞3～5 d時的增殖能力均低于對照組和sh-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；sh-NC組786-O細胞不同時間的增殖能力與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。對照組、sh-NC組、sh-CXCR7組3～5 d時的增殖能力比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同組別786-O腎癌細胞不同時間增殖能力的比較（±s）

表1 不同組別786-O腎癌細胞不同時間增殖能力的比較（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與sh-NC組比較，P＜0.05

組別對照組sh-NC組sh-CXCR7組F值P值0.47±0.09 0.47±0.07 0.48±0.07 0.028＞0.05 1.17±0.12 1.16±0.09 1.03±0.10 2.815＞0.05 1.52±0.19 1.50±0.17 1.13±0.12a b 9.112＜0.01 2.71±0.22 2.69±0.23 1.82±0.17a b 29.750＜0.01 2.83±0.25 2.81±0.21 1.93±0.22a b 25.561＜0.01 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d

2.4 CXCR 7沉默對腎癌細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示，經過無血清培養基誘導后，sh-CXCR7組786-O細胞的凋亡率為（31.57±0.22）%，對照組786-O細胞的凋亡率為（0.25±0.03）%，sh-NC組786-O細胞的凋亡率為（0.27±0.02）%，3組比較，差異有統計學意義（F=317.533，P＜0.01）。Western blot檢測結果顯示，sh-CXCR7組786-O細胞中Bcl-2的表達水平低于對照組和sh-NC組，Bax、cleaved-caspase-3的表達水平均高于對照組和sh-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；3組 786-O 細胞中 Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3表達水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）（表2）。

2.5 CXCR 7沉默對腎癌細胞侵襲、遷移能力的影響

Transwell小室和劃痕實驗結果顯示，對照組、sh-NC組、sh-CXCR7組的侵襲細胞數量和劃痕細胞覆蓋率比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。sh-CXCR7組786-O細胞的侵襲細胞數量均少于對照組和sh-NC組，劃痕細胞覆蓋率均低于對照組和sh-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。sh-NC組786-O細胞的侵襲細胞數量、劃痕細胞覆蓋率與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表3）。Western blot檢測結果顯示，sh-CXCR7組786-O細胞中MMP2、MMP9、VEGF的表達水平均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。sh-NC組與對照組786-O細胞中MMP2、MMP9、VEGF的表達水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表4）。

表2 不同組別786-O腎癌細胞中凋亡相關蛋白表達水平的比較（± s）

表2 不同組別786-O腎癌細胞中凋亡相關蛋白表達水平的比較（± s）

注：a與對照組比P＜0.05；b與sh-NC組比較，P＜0.05

cleaved-caspase-3 0.21±0.02 0.24±0.02 1.15±0.16a b 162.178＜0.01 Bcl-2 0.97±0.19 0.92±0.15 0.47±0.09a b 17.054＜0.01 Bax 0.32±0.04 0.34±0.03 1.63±0.12a b 552.386＜0.01組別對照組sh-NC組sh-CXCR7組F值P值

表3 不同組別腎癌細胞侵襲細胞數量和細胞覆蓋率的比較（±s）

表3 不同組別腎癌細胞侵襲細胞數量和細胞覆蓋率的比較（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與sh-NC組比較，P＜0.05

組別對照組sh-NC組sh-CXCR7組F值P值侵襲細胞數量（個）87.63±8.67 85.29±7.73 44.32±3.23a b 61.226＜0.01細胞覆蓋率（%）62.35±3.42 61.89±3.27 35.81±4.33a b 84.152＜0.01

表4 不同組別腎癌細胞中侵襲和遷移相關蛋白表達水平的比較（±s）

表4 不同組別腎癌細胞中侵襲和遷移相關蛋白表達水平的比較（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與sh-NC組比較，P＜0.05

組別對照組sh-NC組sh-CXCR7組F值P值MMP2 2.17±0.32 2.15±0.33 0.43±0.12a b 66.309＜0.01 MMP9 2.13±0.16 2.10±0.12 0.31±0.09a b 338.742＜0.01 VEGF 0.93±0.17 0.90±0.13 0.27±0.04a b 48.133＜0.01

3 討論

研究表明，趨化因子CXCR7在免疫細胞、血管內皮細胞及多種腫瘤中呈高表達[7]，這可能會促進局部組織的血管新生，在腫瘤的增殖和轉移過程中起著至關重要的作用[8]。有研究發現，CXCR7蛋白在肺組織中呈高表達，且主要存在于腫瘤內部的新生血管和腫瘤組織，而在正常的血管組織中未見其表達水平特異性升高[9]，表明CXCR7蛋白的表達情況可能與腫瘤細胞的增殖能力有關。關于CXCR7蛋白表達所激活的信號通路，研究結果存在一定差異。在關于前列腺癌的研究中，CXCR7蛋白可能介導蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號通路參與細胞調節[10]；在關于肝癌的研究中，CXCR7蛋白更有可能是通過激活細胞的促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路參與細胞功能的調節[11]；在關于結腸癌的研究中，CXCR7蛋白可能通過胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路傳遞細胞調節信號[12]。有研究發現，CXCR7蛋白可能通過抑制腫瘤細胞的凋亡，從而促進腫瘤血管新生，增強腫瘤細胞的增殖和遷移能力[13-15]。

本研究發現，腎癌組織中CXCR7蛋白的表達水平高于健康腎組織（P＜0.05），考慮到腫瘤細胞存在異質性，本研究對常見的腎癌細胞系A498、786-O、ACHN中CXCR7蛋白的表達情況進行進一步研究，結果發現，CXCR7蛋白在3種細胞系中均有表達，其中，在786-O細胞中的表達水平較高，因此，本研究選擇786-O細胞作為研究對象，通過慢病毒轉染構建CXCR7細胞系，研究CXCR7蛋白對786-O細胞增殖、侵襲、遷移的影響，結果發現，與未經慢病毒轉染的對照組相比，經慢病毒轉染的sh-NC組786-O細胞中蛋白的表達水平以及細胞的增殖、侵襲和遷移能力比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；WST-8細胞生長能力檢測結果顯示，與對照組、sh-NC組比較，sh-CXCR7組細胞的增殖能力降低（P＜0.05）；流式細胞術檢測結果顯示，與對照組、sh-NG組比較，下調786-O細胞中CXCR7蛋白的表達后，sh-CXCR7組細胞的凋亡率升高（P＜0.05）；Western blot檢測結果顯示，下調786-O細胞中CXCR7蛋白的表達后，sh-CXCR7組細胞中Bcl-2、MMP2、MMP9和VEGF蛋白的表達水平均有所降低，而促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表達水平有所升高，表明CXCR7蛋白可能是通過抑制促凋亡蛋白的表達，抑制細胞凋亡，從而調控細胞的凋亡信號通路；同時CXCR7蛋白能夠促進VEGF蛋白的表達，有利于新生血管的形成，增加腫瘤組織的營養供給，促進細胞的遷移[16]。

綜上所述，在腎癌組織中，CXCR7蛋白主要通過上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，下調促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表達，從而抑制腫瘤細胞凋亡；同時上調腎癌組織中VEGF、MMP2、MMP9的表達，促進腫瘤內部血管形成，從而增強腫瘤細胞的增殖和遷移能力。