腫瘤微環境相關因子與直腸癌新輔助化療效果及微衛星穩定狀況的關系

羅長順，劉坤，汪黎明

1四川省第二中醫醫院普外科，成都610031

2四川大學華西醫院西藏成辦分院腫瘤科，成都6100000

直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，外科手術為其主要治療手段，但由于直腸癌的解剖學特征較為特殊，因此，直腸癌患者的病死率和復發率均較高[1-2]。腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）是構成腫瘤微環境的主要成分，影響著腫瘤的發展與結局。CD8+、CD4+T細胞對腫瘤細胞具有較強的識別與清除作用，調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）對患者自體同源腫瘤細胞的免疫應答具有抑制作用，也是免疫治療失敗的主要原因。程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）、細胞毒性 T淋巴細胞相關抗原-4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）與Treg協同作用可導致免疫逃逸[3-4]。因此，本研究對新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）前后直腸癌患者腫瘤微環境內免疫標志物的表達情況及PD-L1于直腸癌微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）狀態與微衛星穩定（microsatellite stability，MSS）狀態下的表達差異性進行分析，旨在為直腸癌的臨床診療提供借鑒，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月至2018年6月于四川省第二中醫醫院接受治療的直腸癌患者。納入標準：①患者于NAC后行手術；②治療前經腸鏡活檢確診為直腸腺癌；③臨床資料完整；④確診前未接受過內分泌治療、放療、化療等相關治療。排除標準：①進行過腹部手術或其他重大手術；②術前接受過放療、化療；③手術過程中存在腫瘤廣泛轉移或腹腔廣泛粘連。根據納入和排除標準，本研究共納入90例直腸癌患者，年齡為33～79歲，平均年齡為（55.18±8.72）歲；男51例，女39例；浸潤深度（根據T分期）：T3期28例，T4期62例；分化程度：低分化19例，中分化66例，高分化5例；有淋巴結轉移67例，無淋巴結轉移23例；腫瘤距離肛緣1～13 cm，平均（5.06±1.84）cm。90例直腸癌患者接受了放療聯合化療的方案，放療劑量為25～50 Gy，并于同期接受了2～4個周期的奧沙利鉑+亞葉酸鈣+5-氟尿嘧啶（FOLFOX4）方案化療。

1.2 主要試劑與儀器

試劑：PD-L1（克隆號 sp142）、CD4（克隆號EP204）、CD8（克隆號C8/114B）均購自上海基因科技公司，FOXP3（克隆號236A/E7）購自美國Abcam公司，CTLA-4（克隆號sc-376016）購自美國Santa Cruz公司。儀器：HI1220型烤片機和RM2235型切片機均購自德國Leica公司，PCL-05型免疫組化防脫載玻片購自日本松浪硝子工業株式會社，3500Dx型基因分析儀購自美國ABI公司，加熱振蕩混合儀購自北京鼎昊源科技有限公司。

1.3 組織芯片制備

①采用組織芯片空白陣列蠟塊制備儀制作受體蠟塊，孔徑為1.8 mm，組織陣列為9×16，大小為2.5 cm×4.0 cm；②重新對蠟塊進行切片，病理閱片，標記腫瘤細胞較多的位置，對受體蠟塊對應位置行空芯穿刺針穿孔，取出組織芯；③繪制組織芯片陣列圖，兩個孔上樣于第一行內，應用組織芯片、陣列圖進行定位標記，依據陣列圖將組織芯片填入組織，預防穿刺偏差、掉片或脫片等；④融合，預防孔內組織芯下滑，載玻片內組織芯片倒放，烤箱內放置10 min，室溫冷卻，反復多次以便受體蠟塊和組織芯片融合。

1.4 免疫組織化學染色方法及判定標準

采用免疫組織化學染色法檢測患者治療前的活檢組織標本與治療后的手術切除組織標本，取經石蠟包埋的切片進行脫蠟處理，滅活內源性過氧化物酶，熱修復暴露抗原位點，置入孵育盒內，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次3 min，加入山羊血清，孵育10 min，再加入一抗兔多克隆抗體，4℃下孵育過夜。PBS沖洗3次，每次5分鐘，滴入二抗，室溫下孵育10 min，使用PBS沖洗3次，每次3分鐘，再滴入辣根酶標記的鏈酶卵白素，采用二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，中性樹膠封片。CD4主要表達于間質TIL包膜內，CD8主要表達于間質TIL的細胞質內，PD-L1表達于間質TIL的細胞核內，同時腫瘤細胞也染色；叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3）、CTLA-4均表達于TIL的細胞質內，同時腫瘤細胞染色。每張切片均選取5個高倍視野，每視野選取100個細胞計數，無色為0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；根據陽性細胞所占比例進行評分：＜30%為1分，≥30%為2分；兩項得分相乘，0～1分為陰性，2～6分則為陽性。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測圖像光密度。

1.5 病理評估

由兩位中級及以上職稱的醫師采用雙盲法閱片，選取5個高倍鏡視野，計算TIL的陽性細胞比例，并計算其平均值。NAC前后腫瘤病理反應的評估依據Dworak等[5]的腫瘤退縮分級（tumor regression grade，TRG），共分為TRG 0～4五個等級，TRG0代表腫瘤無消退，腫瘤內纖維化占比低于25%；TRG1代表腫瘤輕度消退，腫瘤內纖維化占比為25%～50%；TRG2代表腫瘤中度消退，腫瘤內纖維化程度高于50%；TRG3代表腫瘤重度消退，僅看到纖維組織，未看到腫瘤組織；TRG4代表腫瘤完全消退。將標本進行分級，TRG3和TRG4患者歸為應答組（28例），TRG0～TRG2患者歸為無應答組（62例）。

1.6 熒光多重聚合酶鏈反應檢測MSI狀況

檢測2個五核苷酸重復標記物（Penta E與Penta D）和5個單核核苷酸重復標記物（MONO-27、NR-24、BAT-26、CAT-25、BAT-25），蠟塊重新制作切片，取8 mm切片2張以便DNA的提取，置于乙醇內5 min，沖洗后晾干，使用刀片刮下組織至EP管內，后行NDA提取，聚合酶鏈反應擴增，最后行毛細管電泳分離，上機檢測，分析數據。采用熒光多重聚合酶鏈反應檢測MSI狀況，結果判定標準：Penta E與Penta D具有較高的多態性和較低的MSI，用于判別正常組織和腫瘤組織是否來源于同一患者。其中，高于2個Markers片段的大小發生改變為微衛星高度不穩定（microsatellite instablehigh，MSI-H），判定是MS（I判別出現變化標準為≥3 bp）；1個Markers片段的大小出現變化為微衛星低度不穩定（microsatellite instable-low，MSI-L），無Markers片段的大小發生改變為MSS。

1.7 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用配對t檢驗和兩獨立樣本t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 直腸癌患者NAC前后免疫標志物表達情況的比較

NAC后，直腸癌患者CD4+TIL、CD8+TIL、CTLA-4+TIL的表達水平均明顯高于NAC前，PD-L1+TIL的表達水平明顯低于NAC前，差異均有統計學意義（P＜0.01）。NAC前后，患者的FOXP3+TIL的表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 直腸癌患者NAC前后免疫標志物表達水平的比較（%，x±s）

2.2 直腸癌患者臨床特征與病理反應的關系

應答組患者28例，無應答組患者62例。兩組患者的年齡比較，差異有統計學意義（t=2.375，P＜0.05）；兩組患者的組織分化程度比較，差異有統計學意義（χ2=7.620，P＜0.05）。兩組患者的淋巴結轉移情況、性別、距離肛緣距離、浸潤深度比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

2.3 免疫標志物表達情況與腫瘤病理反應的關系

NAC前，應答組患者CD4+TIL、PD-L1+TIL的表達水平均高于無應答組，FOXP3+TIL的表達水平低于無應答組，差異均有統計學意義（t=4.068、22.647、20.021，P＜0.01）。應答組患者NAC前后CD4+TIL、PD-L1+TIL、CTLA-4+TIL的表達差值分別為（3.20±0.45）%、（2.81±0.30）%、（1.06±0.64）%，均低于無應答組的（3.89±0.41）%、（3.70±0.34）%、（3.89±0.68）%，而 CD8+TIL、FOXP3+TIL的表達差值分別（4.41±0.32）%、（5.32±0.51）%，均高于無應答組的（0.65±0.31）%、（2.58±0.53）%，差異均有統計學意義（t=7.170、11.908、18.607、52.742、22.968，P＜0.05）。（表3）

表2 不同組別直腸癌患者的臨床特征

表3 不同組別直腸癌患者NAC前后相關腫瘤免疫標志物的表達水平（%，±s）

表3 不同組別直腸癌患者NAC前后相關腫瘤免疫標志物的表達水平（%，±s）

免疫標志物CD4+TIL PD-L1+TIL CD8+TIL FOXP3+TIL CTLA-4+TIL時間治療前治療后治療前治療后治療前治療后治療前治療后治療前治療后應答組（n=28）19.70±5.28 22.90±5.71 13.24±1.05 10.43±1.07 19.98±6.73 24.39±6.37 9.17±2.09 14.49±4.07 7.22±3.19 6.16±3.15無應答組（n=62）14.79±5.31 18.68±5.22 7.50±1.14 3.80±1.19 18.96±6.21 19.61±6.50 19.73±2.41 22.31±4.18 6.89±3.20 9.78±3.61

2.4 PD-L 1與MIS的關系

90例直腸癌患者中，MSI患者40例，MSS患者50例。MSI患者中PD-L1+TIL的陽性細胞比例為（10.49±1.06）%，高于MSS患者PD-L1+TIL的陽性細胞比例（3.09±1.08）%，差異有統計學意義（t=32.566，P＜0.01）。

3 討論

CD4+T細胞不但可通過γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）殺傷腫瘤細胞，還可通過不同路徑將CD8+T細胞激活，被激活的CD8+T細胞可在腫瘤部位積聚，使細胞凋亡[6-7]。本研究結果顯示，NAC后，直腸癌患者CD8+TIL與CD4+TIL的表達水平均高于NAC前，說明NAC前患者機體內的免疫能力普遍較低，而放化療可能會升高CD8+TIL和CD4+TIL的表達水平。但是，NAC前，CD8+TIL的表達水平對于患者的療效無明顯影響，說明與之前的局部免疫應答狀況相比，行NAC時放化療對患者腫瘤免疫微環境的影響更重要[8-10]。

T細胞可激活負性信號，并通過與B7相互影響從而抑制T細胞活化，進而刺激CTLA-4的陽性表達。同時，相關研究表明CTLA-4與患者的不良預后有一定關系[11]。本研究結果顯示，NAC后，患者CTLA-4+TIL的表達水平較治療前升高，說明放化療殺傷腫瘤細胞可使腫瘤細胞分泌抑制因子，使共刺激分子CD80/CD86或樹突狀細胞表層主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）分子的表達水平發生變化，CTLA-4亦出現變化。Treg對機體自體同源腫瘤細胞的免疫應答有抑制作用，通常被認為是導致免疫治療失敗的主要因素。目前，FOXP3被認為是Treg具有特異性的標記物[12-14]。本研究結果顯示，NAC前后，患者FOXP3+TIL的表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），但NAC前后FOXP3+TIL低表達者易達到應答狀態。在臨床中，放化療選擇性的消耗會提高部分患者抗腫瘤免疫的發生率，利于腫瘤消退，但NAC所引發的腫瘤周邊Treg不良反應亦會增多。

PD-L1是存在于T淋巴細胞表層的一種抑制分子，由樹突狀細胞、T細胞、巨噬細胞和B細胞等表達，其表達量于激活抗原呈遞細胞后升高。在正常機體中，PD-1/PD-L1信號通路對維持機體的免疫耐受具有重要作用。研究發現，PD-L1在多種腫瘤中的表達上調，在腫瘤免疫應答中發揮重要作用[15-17]。但是，本研究中，NAC后，PD-L1+TIL的表達水平明顯低于NAC前（P＜0.01），說明NAC可降低PD-L1在腫瘤中的表達水平，進而通過腫瘤免疫應答提高治療效果。PD-1/PD-L1信號通路可通過多方面對T細胞起到負性調節的作用，但PD-1不是PD-L1所介導的唯一受體，PD-L1還可導致PD-1陰性T淋巴細胞凋亡，說明T淋巴細胞內可能存在導致PD-L1免疫抑制的相關受體。本研究結果顯示，MSI直腸癌患者PD-L1+TIL內的陽性細胞比例高于MSS直腸癌患者，說明直腸癌MSI狀態可能導致PD-L1+TIL內的陽性細胞高表達，進而影響直腸癌患者的臨床療效。

綜上所述，MSI直腸癌患者腫瘤微環境內PDL1+TIL的陽性率較高，PD-L1阻斷劑可能對MSI直腸癌患者的療效更好。但是，PD-L1+TIL表達與直腸癌患者臨床療效的關系仍需今后更進一步深入探究。