配對盒基因8在不同類型甲狀腺癌細胞中的表達及對細胞增殖及攝碘能力的影響

張昕，周作枝，崔雁飛，齊創，向東華

恩施土家族苗族自治州中心醫院中西醫結合腫瘤科，湖北 恩施4450000

甲狀腺癌是最常見的內分泌系統惡性腫瘤，包括乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌和髓樣癌，其中乳頭狀癌惡性度較低、預后較好，甲狀腺癌患者的預后與病理類型密切相關[1-2]。中國以乳頭狀癌和濾泡狀癌較為常見，前者多發于碘充足地區，后者好發于碘缺乏地區；近年發現甲狀腺癌發病率呈上升趨勢，尤以女性多見[3]。研究發現，基因突變、易位及甲基化等在甲狀腺癌發生發展過程中占重要地位，以上異?？赏ㄟ^激活腫瘤相關信號通路，誘發細胞癌變[4]。配對盒基因8（paired box 8，PAX8）位于人染色體2q12-q14，是PAX家族的重要成員之一，可限制基因轉錄。研究發現，PAX8對胚胎甲狀腺、神經系統、腎等器官發育至關重要，在甲狀腺濾泡狀癌研究中呈高表達，表明其亦可參與甲狀腺癌的發生發展[5-6]。但關于PAX8與甲狀腺癌增殖及治療研究少見，本研究通過構建重組質粒探討PAX8對甲狀腺乳頭狀癌細胞和濾泡狀癌細胞增殖及攝碘能力的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑盒儀器

人正常甲狀腺細胞株HTori-3、人甲狀腺乳頭狀癌細胞株NPA87和人甲狀腺濾泡狀癌細胞株ML-1均購自中國科學院上海生科院研究所，高糖DMEM、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）及胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，總RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒均購自上海碧云天生物有限公司，miS-cript SYBR Green聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購自德國Qiagen公司，噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑粉末、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶劑均購自美國Sigma公司，鈉碘轉運體（sodium iodide transporter，NIS）抗體和兔抗鼠-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）抗體均購自美國Millpore公司，放射性Na131I溶液購自中國工程物理研究院，細胞固定穿孔試劑盒購自美國BD公司，pcDNA3.1/NT-GFP-PAX8過表達質粒和pcDNA3.1/NT-GFP空載質粒均由上海吉凱生物科技有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 正常甲狀腺細胞株HTori-3、甲狀腺乳頭狀癌細胞株NPA87和甲狀腺濾泡狀癌細胞株ML-1充分解凍后，接種于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，于5%CO2、37℃、飽和濕度培養箱培養，根據細胞密度1～2天換液1次，3～5天傳代1次。

1.2.2 實時熒光定量PCR法檢測PAX 8mRNA的相對表達量 取正常甲狀腺細胞株HTori-3、甲狀腺乳頭狀癌細胞株NPA87和甲狀腺濾泡狀癌細胞株ML-1，依據總RNA提取、逆轉錄和miScript SYBR Green PCR試劑盒操作說明書完成總RNA提取、cDNA制備和PCR擴增，其中PCR擴增體系為50 μl，反應條件：94 ℃ 15 min，92 ℃ 30 s，60 ℃28s，70 ℃ 28 s，共40個循環。以β-actin為內參，以2-△△Ct計算PAX8mRNA的相對表達量。本實驗重復3次。

1.2.3 轉染及分組方法 取甲狀腺乳頭狀癌細胞株NPA87和甲狀腺濾泡狀癌細胞株ML-1，分別轉染pcDNA3.1/NT-GFP-PAX8過表達質粒和pcDNA3.1/NT-GFP空載質粒，分別作為過表達組、空載組，建立穩定轉染細胞系，將未做處理的細胞作為空白對照組。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖能力 取甲狀腺乳頭狀癌細胞株NPA87和甲狀腺濾泡狀癌細胞株ML-1過表達組、空載組和空白對照組對數生長期細胞，調整細胞濃度為4×105/ml，取100 μl接種于96孔板上，每組設置3個復孔，共培養5天，于第1、3、5天，分別取3孔分別加入20 μl的MTT（37℃水浴箱孵育4 h）和100 μl的DMSO（充分震蕩混勻5 min），置于EXL800酶聯免疫分析儀上測定各孔490 nm處的光密度（optical density，OD）值，繪制曲線獲取細胞數。本實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞NIS蛋白的表達量取甲狀腺乳頭狀癌細胞株NPA87和甲狀腺濾泡狀癌細胞株ML-1過表達組、空載組和空白對照組對數生長期細胞，調整細胞濃度為4×105/ml，取100 μl接種于96孔中，每組設置3個復孔，共培養5天，于第1、3、5天分別取3孔制備成單細胞懸液，后用細胞固定穿孔試劑盒對細胞進行固定穿孔，并加入NIS抗體，4℃反應60 min，緩沖液沖洗3次后，加入FITC標記兔抗鼠二抗，37℃水浴箱孵育30 min，緩沖液洗3次，采用流式細胞儀檢測NIS熒光強度。本實驗重復3次。

1.2.6 攝碘能力實驗檢測細胞攝碘能力 取甲狀腺乳頭狀癌細胞株NPA87和甲狀腺濾泡狀癌細胞株ML-1過表達組、空載組和空白對照組對數生長期細胞，調整細胞濃度為4×105/ml，取100 μl接種于96孔板中，每組設置3個復孔，共培養5天，于第1、3、5天分別取3孔進行分析，每孔加入0.5 μCi的131I溶液500 μl，繼續培養60 min；棄液，低溫預冷Hank's平衡鹽溶液（Hank's balanced salt solution，HBSS）洗滌3次，加入500 μl甲酸細胞裂解液20 min；吸取以上溶液至測量管中，并利用γ計數儀測量放射性活度，繪制曲線獲取相對碘吸收量。本實驗重復3次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對所有數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多個時間點重復測量采用重復測量方差分析，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較t檢驗；PAX8與NIS蛋白的關系采用Pearson法分析；采用Image proplus軟件對免疫熒光強度進行半定量分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PAX 8 mRNA相對表達量的比較

正常甲狀腺細胞株HTori-3、甲狀腺乳頭狀癌細胞株NPA87中PAX8mRNA的相對表達量均高于甲狀腺濾泡狀癌細胞株ML-1，正常甲狀腺細胞株HTori-3中PAX8mRNA的相對表達量高于甲狀腺乳頭狀癌細胞株NPA87，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同類型甲狀腺細胞PAX 8 mRNA相對表達量的比較（±s）

表1 不同類型甲狀腺細胞PAX 8 mRNA相對表達量的比較（±s）

注：a與正常甲狀腺細胞株HTori-3比較，P＜0.05；b與甲狀腺乳頭狀癌細胞株NPA87比較，P＜0.05

細胞PAX8 mRNA正常甲狀腺細胞株HTori-31.53±0.09甲狀腺乳頭狀癌細胞株NPA871.21±0.10a甲狀腺濾泡狀癌細胞株ML-10.69±0.08a bF值323.83P值0.000

2.2 細胞增殖活性的比較

培養第1天，NPA87細胞和ML-1細胞過表達組、空載組和空白對照組細胞數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；培養第3、5天，NPA87細胞和ML-1細胞中，過表達組細胞數均低于空載組和空白對照組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）；但空載組和空白對照組細胞數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 培養第 1、 3、 5天各組細胞數比較（×10 4，±s）

表2 培養第 1、 3、 5天各組細胞數比較（×10 4，±s）

注：a與甲狀腺乳頭狀癌細胞株NPA87過表達組比較，P＜0.05；b與甲狀腺濾泡狀癌細胞株ML-1過表達組比較，P＜0.05

細胞 時間 過表達組 空載組 空白對照組甲狀腺乳頭狀癌細胞株 第1天4.15±0.024.13±0.014.12±0.02 NPA87第3天4.38±0.025.12±0.06a5.14±0.01a第5天4.56±0.036.15±0.04a6.13±0.07a甲狀腺濾泡狀癌細胞株 第1天4.06±0.034.26±0.024.64±0.04 ML-1第3天4.11±0.015.87±0.03b6.86±0.04b第5天4.08±0.015.89±0.02b6.81±0.07b

2.3 NIS蛋白表達情況

在NPA87細胞和ML-1細胞中，過表達組細胞NIS蛋白熒光強度高于空載組和空白對照組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05），但空載組和空白對照組NIS蛋白熒光強度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表3、圖1）

表3 各組細胞NIS蛋白熒光強度的比較（%，±s）

表3 各組細胞NIS蛋白熒光強度的比較（%，±s）

注：a與甲狀腺乳頭狀癌細胞株NPA87過表達組比較，P＜0.05；b與甲狀腺濾泡狀癌細胞株ML-1過表達組比較，P＜0.05

細胞 過表達組 空載組 空白對照組甲狀腺乳頭狀癌細胞株172.49±5.48110.38±6.22a111.55±4.62a NPA87甲狀腺濾泡狀癌細胞株175.36±3.64112.67±5.19b109.31±5.06b ML-1t值0.7560.4890.566P值0.4920.6500.602

圖1 NPA87細胞和ML- 1細胞中各組細胞NIS蛋白表達熒光圖（×400）

2.4 攝碘能力的比較

在NPA87細胞和ML-1細胞中，過表達組細胞相對碘吸收量高于空載組和空白對照組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05），但空載組和空白對照組相對碘吸收量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表 4）

表4 各組細胞相對碘吸收量比較（%，±s）

表4 各組細胞相對碘吸收量比較（%，±s）

注：a與甲狀腺乳頭狀癌細胞株NPA87過表達組比較，P＜0.05；b與甲狀腺濾泡狀癌細胞株ML-1過表達組比較，P＜0.05

細胞 過表達組 空載組 空白對照組甲狀腺乳頭狀癌細胞株159.75±7.23110.35±2.19a101.31±2.08a NPA87甲狀腺濾泡狀癌細胞株161.72±6.11105.74±2.52b101.34±0.58b ML-1t值0.3612.3920.024P值0.7370.0750.982

2.5 PAX 8與NIS蛋白的相關性

Pearson相關分析結果顯示，PAX8與NIS蛋白呈正相關（r=0.915，P＜0.05）。

3 討論

甲狀腺癌的治療方式主要包括手術、甲狀腺激素抑制療法、靶向治療和放射性131I治療，其中手術、甲狀腺激素抑制療法、靶向治療對高分化型甲狀腺癌的效果明顯，預后良好，但對低分化型甲狀腺癌的效果不明顯，隨后的研究發現，131I放射治療是分化差甲狀腺癌治療中不可或缺的環節[7-8]。NIS基因位于人19號染色體短臂上，其編碼的NIS蛋白是一種具有跨膜結構糖蛋白，主要表達于甲狀腺濾泡細胞基底膜上，可通過主動轉運血液中碘離子進入甲狀腺濾泡上皮細胞參與碘的機體代謝，是評價細胞攝碘能力的關鍵指標[9-10]。NIS蛋白在正常甲狀腺組織中表達水平較高，但在甲狀腺瘤、甲狀腺癌等相關疾病中表達異常，結果各具差異；有研究認為者與患者的基因表達相關[11-12]。

本研究以正常甲狀腺細胞作為參照，選取臨床較為常見兩種細胞——乳頭狀癌細胞NPA87和濾泡狀癌細胞ML-1進行研究，結果發現，PAX8基因在甲狀腺乳頭狀癌和濾泡狀癌細胞中均呈低表達，且泡狀癌細胞更低，表明PAX8基因可能作為抑癌基因參與甲狀腺癌的發生發展，推測PAX8基因可能會抑制腫瘤細胞增殖，且對濾泡狀甲狀腺癌作用更明顯，國內外的相關報道較少，具有一定研究價值。為進一步探討PAX8基因對不同類型甲狀腺癌細胞的影響，本研究設計并構建了PAX8過表達質粒，可靶向提升PAX8的表達水平，同時設立質粒空載組和空白對照組，排除質粒和腫瘤細胞本身對研究的干擾，設計基本合理，效果尚好，結果發現，培養第3、5天，NPA87細胞和ML-1細胞中，過表達組細胞數均低于空載組和空白對照組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）。表明PAX8過表達可抑制甲狀腺癌細胞增殖，驗證了上述猜想。

NIS蛋白與131I放射治療密切相關，是實施131I放射治療的前提，提高腫瘤細胞攝碘能力意義重大，可有效改善甲狀腺患者預后；基因治療雖可達到靶向治療的目的，但遠期預后仍不清楚，聯合治療在一定程度上可延長其有效期[13]。為此，本研究就PAX8基因與甲狀腺癌細胞NIS蛋白和相對碘吸收量關系進行探討，結果發現，在NPA87細胞和ML-1細胞中，過表達組細胞NIS蛋白熒光強度和相對碘吸收量均高于空載組和空白對照組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05），但空載組和空白對照組NIS蛋白熒光強度和相對碘吸收量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；此外，Pearson相關分析結果顯示，PAX8與NIS蛋白呈正相關。但NPA87細胞和ML-1細胞中，空載組和空白對照組細胞數、NIS蛋白熒光強度和相對碘吸收量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），與前面關于PAX8mRNA細胞類型的差異性相悖，這可能是因為體外研究中相互作用比較單一，關聯性較差，具體原因及機制有待后續研究。

綜上所述，PAX8基因在甲狀腺乳頭狀癌和濾泡狀癌細胞中均呈低表達，且后者表達水平更低；過表達PAX8可抑制甲狀腺癌細胞增殖，促進NIS蛋白表達，增強攝碘能力。