重組雞干擾素α 生物學活性測定方法的研究及其驗證

高應瑞，劉珂飛，孟鐵健，徐 鑫

（天津生機集團股份有限公司 300384）

干擾素(IFN)是一類具有抗病毒，影響細胞生長、分化和調節免疫功能等活性的蛋白質。 根據干擾素的氨基酸結構、抗原性和細胞來源，可將其分為三類：IFN-a、IFN-β 和IFN-γ。據資料報道，實驗證明，重組的雞α 干擾素在抵抗水泡性口炎病毒、勞斯肉瘤病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、傳染性支氣管炎病毒、馬立克病毒、禽流感病毒等，都有明顯的效果，能顯著抑制病毒的生長[1-4]。

2014 年,程福亮等人在重組雞α-干擾素的表達及其生物活性的初步研究中，應用在CEF/VSV 細胞系上測定了重組雞α-干擾素的抗病毒效價為1.5×210 U/mg 左右[5]；2018 年，趙澤在雞、羊λ3-干擾素在家蠶中的表達及其抗病毒活性檢測中，采用微量細胞病變抑制法在VSV-GFP 系統上檢測所表達的重組干擾素抗病毒活性,根據Reed-Muench 法計算效價[6]。 范逸文在雞INFγ-C3d 在畢赤酵母中的表達及抗病毒活性測定中將真核表達的重組蛋白chIFN-γ 和chIFN-γ-C3d 以及實驗室保存的原核表達的重組蛋白chIFN-γ 和chIFN-γ-C3d 進行雞胚內和雞胚成纖維細胞(CEF)抗病毒活性比較[7]；王朋在對鴨α、γ、λ 干擾素在家蠶中的表達及其抗病毒活性檢測研究中， 同樣采用的細胞病變抑制法來測定器干擾素的生物活性， 采用的病毒體系為VSV 病毒[8]。 鄒歡在對鴨α-干擾素的真核與原核表達及生物活性的比較研究中，同樣適用了VSV 病毒體系來測定干擾素生物活性[9]。

目前我國尚無重組雞干擾素α 生物學活性測定方法國家標準，由農業農村部主編的《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》(2001 版)豬白細胞干擾素[10]、《中國藥典》“注射用重組人干擾素α1b”、“重組人干擾素α1b 注射液”都是采用細胞病變抑制法測定生物學活性[11]。 本研究參照采用目前公認的“微量細胞病變抑制法”(簡稱CPE 抑制法)，采用雞胚成纖維細胞(CEF)/水皰性口炎病毒(VSV) 系統以及雞胚成纖維細胞(CEF)/新城疫病毒(NDV)系統測定了同批次的8 組不同濃度的rChIFN-α 樣品生物學活性，現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和病毒

雞胚成纖維細胞(CEF)參照《中國獸藥典》中“細胞單層制備法”中“雞胚成纖維（CEF）單層的制備” 方法[12]，由SPF 雞胚提取傳代而來，SPF 雞胚購買于北京梅里亞維通動物有限公司， 水泡性口炎病毒(VSV)購買于中國食品藥品檢定研究院、新城疫病毒(NDV F18)由中國農業大學動物醫學院贈予。

1.1.2 試劑

DMEM 培養基、胰蛋白酶購自GIBCO 公司，小牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司， 其他試劑均為進口或國產分析純。

1.1.3 重組雞干擾素α 樣品

本實驗測定用的重組雞干擾素α 由本公司生產制備， 批號為20180501，效價標識為1.0×109IU/瓶，使用前采用生理鹽水稀釋成8 個不同濃度樣本。

1.1.4 標準品

購自中國食品藥品檢定研究院， 重組人干擾素α2b 國家標準品，批號：270004-201301，效價為4.27×105IU/支，下稱標化干擾素。

1.2 方法

1.2.1 CEF 細胞的原代、傳代培養

1.2.1.1 原代培養

（1）將選好的9～10 日齡的發育良好的SPF 胚用5%的碘棉消毒蛋殼氣室部位，再用酒精棉脫碘。

（2）無菌取出雞胚，放入滅菌的玻璃皿內，用pH7.2 的PBS沖洗一次，去頭，四肢和內臟。

（3）再用pH7.2 的PBS 沖洗兩次。

（4）用鑷子捏成小塊（2～3mm3）, 用pH7.2 的PBS 沖洗兩次。

（5） 雞胚約加4mL0.25%胰酶溶液，38℃消化30min， 期間15min 輕搖一次。

（6）消化結束，棄掉胰酶消化液，用pH7.2 的PBS 沖洗兩次，再用細胞生長液沖洗一次。

（7）加入適量的細胞生長液，用刻度吸管反復吹打（使細胞充分分散）。

（8）將細胞分散液倒入帶6～8 層紗布的100mL 燒杯中（過濾之前先用少許細胞培養液潤濕紗布），加入適量培養液（40mL/胚），過濾。

（9）重復步驟⑨的操作重慮一遍。

（10）計數，要求每1mL 濾液中約含活細胞100 萬～150 萬個。

（11）分裝置個培養瓶中（5～8ml/瓶），置37℃培養箱培養。

1.2.1.2 傳代培養

在顯微鏡下觀察細胞生長情況， 當細胞生長至鋪滿單層后，進行細胞傳代，棄去細胞培養液，用PBS 液沖洗3 次，再加入0.25%的胰蛋白酶消化液消化3～5min，棄去消化液，加入適量的含10%小牛血清DMEM 培養基的營養液， 用吸管充分吹打，使之從瓶內壁脫落形成細胞懸液， 吸取一半細胞懸液移至另一細胞瓶內，置37℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2.2 VSV/NDV 病毒滴度測定(TCID50 法)

1.2.2.1 單層細胞制備

將CEF 細胞消化后加入適量的營養液制成5×105/mL 的單細胞懸液， 用微量移液管將其加入96 孔細胞培養板的微孔中，每孔100μl，37℃，5% CO2培養箱培養24h，形成單層，做病毒滴定用。

1.2.2.2 接種病毒

將長好單層細胞的培養板各孔細胞液傾棄，用吸管把各稀釋度的VSV 病毒（或NDV 病毒）從低濃度開始依次加入各孔中，每孔100μl，細胞對照孔不加病毒液，只加維持液。 置37℃，5%CO2培養箱中孵育。

1.2.2.3 結果觀察

于孵育后每隔12h 在倒置顯微鏡下觀察CPE，直至病變不再變化為止，終止培養，然后棄去細胞培養板中的上清液，每孔加入染色液50μl，室溫放置30min 后，用流水小心沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液100μl，室溫放置3～5min,混用后，用酶標儀以630nm 為參比波長，在波長570nm 處測定習慣度，記錄測定結果。 以Reed-Muench 法[13]計算rChIFN-α 工作單位，并經重組人干擾素α2b 校正后得到國際單位的抗病毒活性。對所測樣品進行重復測定，方法同上，重復4 次，并對所得結果進行統計學分析。

1.2.3 微量細胞病變抑制法滴定rChIFN-α 效價

1.2.3.1 供試品溶液的制備

將供試品溶液用測定培養液稀釋至蛋白含量約0.1mg/mL，然后在96 孔細胞培養板中，從1∶100 開始依次做4 倍梯度稀釋，每個稀釋度做復孔，共做10 個稀釋度(1～10 孔)。

1.2.3.2 標準品溶液的制備

取重組人干擾索α2b 國家標準品，按說明書復溶后，用營養液稀釋至每lmL 含10000 單位， 在96 孔細胞培養板中， 做4倍梯度稀釋，每個稀釋度做復孔，共做10 個稀釋度（1～10 孔）。

1.2.3.3 測定法

取孵育10 日齡發育良好的SPF 雞胚。 參照《中國獸藥典》中“細胞單層制備法”中“雞胚成纖維（CEF）單層的制備”方法進行制備雞胚成纖維細胞， 用完全培養液配制成每1mL 含5.0×105～6.0×105個細胞的細胞懸液。

CEF 細胞在培養條件下呈貼壁生長狀態。 常規下細胞按1∶2～1∶4 傳代，每周2～3 次，于營養液中生長。 具體操作簡述為：將長滿單層細胞瓶內培養液棄去， 用PBS 洗2 次后消化和收集細胞，將5.0×105～6.0×105個細胞的細胞懸液接種于96 孔細胞培養板中，每孔100μl。 于37℃、5%二氧化碳條件下培養18～24h。 將配制完成的供試品溶液移入接種CEF 細胞的培養板中， 每孔加入100μl。于37℃、5%二氧化碳條件下培養18～24h。棄去細胞培養板中的上清液。 將保存的水泡口炎病毒或雞新城疫病毒（NDV，-70℃保存） 用攻毒培養液稀釋至約100TCID50， 每孔100μl。 于37℃、5%二氧化碳培養24h 第11 號孔為病毒對照，不加干擾素保護，加病毒攻擊；第12 號孔為細胞對照，不加干擾素保護，也不加病毒攻擊。

1.2.3.4 結果觀察

每隔24h 培養物置倒置顯微鏡下觀察。 首先觀察“細胞對照孔”和“病毒對照孔”，鏡檢病毒對照孔可見細胞圓縮脫落而細胞對照孔正常。 然后棄去細胞培養板中的上清液，每孔加入染色液50μl，室溫放置30min 后，用流水小心沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液100μl[14]，室溫放置3～5min。 混勻后，用酶標儀以630nm 為參比波長， 在波長570nm 處測定吸光度，記錄測定結果。

用Reed-Muench 法計算rChIFN-α 生物活性單位。 對所測樣品進行重復測定，方法同上，重復4 次，并對所得結果進行統計學分析。

1.2.4 統計學分析

對所得數據進行相關性分析，并對兩株病毒所測得的抗病毒活性及細胞與待測樣品的不同加入方法所得結果進行配對t檢驗。

2 結果

2.1 VSV / NDV TCID5050 測定結果

分別將VSV / NDV 病毒進行TCID50 測定， 結果顯示CEF細胞上VSV 病毒TCID50 為5.0×105/0.1mL，NDVTCID50 為1.0×106/0.1mL。

2.2 兩株病毒檢測rChIFN-α 生物學活性相關性結果

用結晶紫染色法分別在兩種病毒株上(CEF/VSV 和CEF/NDV)對不同濃度干擾素樣品測定了16 組數據，經統計學分析，2株病毒所測rChIFN-α 抗病毒活性具有很好的相關性，r=0.9999；經配對t 檢驗分析，2 組數據差異無顯著意義(P=0.993726>0.05)，見圖1。

2.3 兩株病毒測rChIFN-α 生物學活性重復性檢測結果

圖1 兩株病毒株測定rChIFN-α 效價的相關性結果

用微量細胞病變抑制法，分別在兩種病毒株上(CEF/VSV 和CEF/NDV)對不同濃度干擾素樣品進行重復性試驗，檢測4 次結果，兩種病毒株重復性均較好，CV 值均＜10%，但CEF/VSV 系統測定的rChIFN-α 生物學活性結果cv 值要低于CEF/NDV 系統，詳細結果分別見表1 和表2。

3 結論與討論

表1 CEF/ NDV 系統測定rChIFN-α 生物學活性重復性檢測結果

表2 CEF/ VSV 系統測定rChIFN-α 生物學活性重復性檢測結果

目前我國尚無重組雞干擾素α 生物學活性測定方法國家標準，干擾素的效價取決于檢測所用的細胞、病毒系統以及被測樣品的類型。 而細胞病變抑制法無疑使測定干擾素小效價的唯一方法。

目前在已經報道的重組雞干擾素α 生物學活性測定研究中，均采用的是細胞病變抑制法，主要是兩類，一類是以NDV 病毒作為細胞病變的攻毒毒株， 如岳敏杰在對雞干擾素α 在枯草芽孢桿菌中的表達及活性檢測中，用的攻毒病毒為NDV 病毒[15]，魏雙施也在其對重組雞α 干擾素的高效表達、 復性純化和抗病毒研究中采用了CEF/NDV 檢測系統[16]；另外一類是以VSV 病毒作為病變系統的攻毒毒株， 如李皓洋在雞干擾素α 和γ 在家蠶中的表達及其抗病毒活性檢測中采用的CEF/VSV 系統等[17]。

本研究針對兩個病毒體系進行了比較研究，表明，rChIFNα 在CEF/VSV 和CEF/NDV 兩個系統中所測的效價基本一致，測定rChIFN-α 樣品效價的重復性較好。 以上結果說明了rChIFNα 的測定中CEF/VSV 系統測定結果的CV 值要低于CEF/NDV系統，且用VSV 作為攻毒株作為病變毒株更符合干擾素測定標準，因此更適用于實驗室對rChIFN-α 的生物學活性檢測。