高效液相色譜-二極管陣列檢測器法測定復合維生素B片中5種組分的溶出度

紀世彬

作者單位：上海市青浦食品藥品檢驗所檢驗室，上海201799

藥物的溶出度檢查是對工藝水平和制劑品質的一種有效的評價手段，可以反映藥物的生產工藝、處方組成、晶型、粒度和輔料品種等的差異，也是有效評價制劑均勻度、活性成分和生物利用度的標準。溶出度作為體外實驗相較生物利用度而言簡單易行，作為質量控制的指標，不失為一個經濟有效的手段［1］。復合維生素B片由泛酸鈣、維生素B1、煙酰胺、維生素B2、維生素B6五種有效成分加工而成，臨床用于治療和預防由B族維生素缺乏所導致的各種疾病，現行的質量標準《衛生部頒藥品標準》化學藥品及制劑第一冊WS1-73（B）-89中僅規定了崩解時限檢查項［2］，但崩解時限檢查不能全面反映藥物在體內的溶出情況，本研究自2018年7月至2019年1月建立的方法為考察復合維生素B片中5種維生素的體內溶出情況提供了一種客觀的標準［3-5］。

1 儀器與試藥

1.1儀器Waters 2695高效液相色譜儀（配2996型二極管陣列檢測器）、BP211D電子天平（德國賽多利斯公司）、ZRS-8G智能溶出試驗儀（天津天大天發科技有限公司）。

1.2試劑和藥品煙酰胺（批號：100115-200703，含量：99.9%，100毫克∕支）、維生素B1（批號：100390-201304，含量：97.0%，100毫克∕支）、維生素B2（批號：100369-201504，含量：98.2%，100毫克∕支）、泛酸鈣（批號：100370-200301，含量：100%，100毫克∕支）、維生素B6（批號：100116-201103，含量：100%，100毫克∕支）均購自中國食品藥品檢定研究院。復合維生素B片①（南京白敬宇制藥有限責任公司，生產批號180102）；復合維生素B片②（上海新黃河制藥有限公司，生產批號02418002）；乙腈、庚烷磺酸鈉（色譜純），冰乙酸、三乙胺（分析純），鹽酸（優級純），水（超純水）。

2 方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以5 mmol∕L庚烷磺酸鈉水溶液（含0.15%三乙胺，用冰醋酸調節pH值至5.0）為流動相A，以乙腈為流動相B；梯度洗脫：0～4 min，95%A；4～15 min，95%～80%A；15～20 min，80%～95%A；20～25 min，95%A；流速：1.0 mL∕min；進樣量：50μL；柱溫：3 5℃；檢測波長：280 nm（煙酰胺、維生素B2、維生素B6和維生素B1），210 nm（泛酸鈣）。

2.2溶液的配置

2.2.1 對照品溶液 精密稱取維生素B1對照品、維生素B2對照品、維生素B6對照品、及泛酸鈣對照品各10 mg，分別置于20、100、100、100 mL容量瓶，加0.005 mol∕L鹽酸溶解并稀釋至刻度。搖勻，作為對照品貯備液（1）、（2）、（3）、（4）。精密取煙酰胺對照品10 mg，置50 mL容量瓶中，精密加入對照品貯備液（1）5 mL、（2）20 mL、（3）3 mL、（4）10 mL，加0.005 mol∕L鹽酸溶解并稀釋至刻度。

2.2.2 供試品溶液 按《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0931第三法操作，以0.005 mol∕L鹽酸100 mL為溶出介質，于（37±0.5）℃條件下，轉速為100 r∕min，于20 min取樣1 mL，立即經0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液，依法測定，計算累計溶出百分率。

2.3檢出限試驗及線性關系分別精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液2、4、6、8及10 mL分別置10 mL量瓶中，加0.005 mol∕L鹽酸稀釋至刻度，搖勻。取50μL注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積。結果以峰面積y為縱坐標，以各組分的濃度x為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。同時分別以信噪比約為10∶1和3∶1時的濃度作為定量限和檢測限。結果見表1。

2.4精密度試驗精密吸取標準曲線三號濃度梯度標準溶液50μL，注入液相色譜儀，連續6次進樣測定峰面積，分別計算RSD。結果維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6、泛酸鈣的RSD分別為0.18%、0.10%、0.51%、0.65%、0.66%。

2.5穩定性試驗取復合維生素B片②20 min時的供試品溶液①，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h后進樣測定。結果顯示，維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6、泛酸鈣色譜峰面積的RSD分別為0.25%、0.17%、0.50%、0.45%、0.82%。

2.6加樣回收試驗在溶出杯中按配方加入復方維生素B片②的輔料，取維生素B1、維生素B2、維生素B6與泛酸鈣對照品配置成每毫升各含500、450、50與200μg的混合溶液，分別取2、5、8 mL各3份，置于溶出杯中；取煙酰胺對照品配置成每毫升含1 mg的溶液，分別取5、10、15 mL各3份，置于上述溶出杯中，每個溶出杯加入0.005 mol∕L鹽酸至100 mL，按“2.2.2”項下的方法，記錄色譜圖見圖1，由結果可知，維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6、泛酸鈣的平均回收率分別為98.0%、98.7%、99.2%、96.0%、95.5%；RSD分別為0.45%、0.40%、0.19%、0.85%、0.90%（n＝9）。表明該方法回收率良好。

表1 回歸方程、檢測限和定量限

圖1 各成分的高效液相色譜圖：A為對照品溶液280 nm，B為對照品溶液210 nm，C為樣品溶液280 nm，D為樣品溶液210 nm

3 討論

3.1檢測波長的選擇利用DAD檢測器，在各個波長處測定各個組分的吸收，確定最大吸收波長，同時兼顧各個組分定量測定的需要，最后選擇280 nm作為維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6的測定波長，選擇210 nm作為泛酸鈣的測定波長。

3.2流動相的選擇流動相中加庚烷磺酸鈉，和一定量三乙胺是為了改善組分的峰型和保留時間以及消除拖尾，試驗過程中發現pH值對維生素B1和維生素B2峰的保留時間也有影響，過低過高都不能達到理想的色譜分離或者總時間。由于泛酸鈣檢測波長為210 nm，考慮到甲醇的截止波長為205 nm，故有機相確定為乙腈。經反復試驗，最后將流動相優化成為5 mmol∕L庚烷磺酸鈉水溶液（含0.15%三乙胺，用冰醋酸調節pH值至5.0）為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫。

3.3溶出度取樣時間及溶出介質的選擇根據“2.2.2”項下方法，分別以50和100 r∕min的轉速，以水、0.1 mol∕L鹽酸溶液和0.005 mol∕L鹽酸溶液，于10、20、30、45、60 min取樣1 mL（同時補充預熱至37℃的溶出介質1 mL），測定溶出百分率。根據測定結果，在水中泛酸鈣的溶出量偏低；在0.1 mol∕L鹽酸溶液中，各組分的溶出量都偏低；在0.005 mol∕L鹽酸溶液中50 r∕min時在45 min時5種維生素的溶出率都達到95%以上；100 r∕min時在20 min時5種維生素的溶出率都達到95%以上。綜合以上結果，選擇100 r∕min，取樣時間為20 min的溶出條件。因維生素B2對光較敏感，見光易分解，故應避光操作。

4 結論

本方法準確，簡便，可作為現行質量標準的補充，測定復合維生素B片中五種維生素的溶出度，更全面評價該制劑的質量。