西格列汀對高糖誘導內皮細胞凋亡的改善作用及機制研究

豐磊，張婷，張金金，趙嵐

作者單位：1南陽油田總醫院內分泌科，河南 南陽 473132；2南陽醫學高等專科學校基礎醫學部，河南 南陽 473000

動脈粥樣硬化是2型糖尿病病人常見的并發癥之一，同時也是增加心肌梗死、腦梗死等疾病發生風險的獨立危險因素。內皮細胞位于血管最內層、是血管與血液循環之間的第一道防線，高糖誘導內皮細胞凋亡是糖尿病病人發生動脈粥樣硬化的重要病理環節，針對內皮細胞凋亡進行干預是防治糖尿病病人動脈粥樣硬化的有效靶點［1-2］。西格列汀是近年來廣泛用于降糖治療的二肽基肽酶4（DPP4）抑制劑，通過抑制DPP4活性、增加胰高血糖素樣肽-1的含量來起到降糖作用［3］。已有研究報道，西格列汀能夠在高糖環境下增加內皮細胞中內皮型一氧化氮合酶的表達［4］，提示西格列汀可能在高糖環境下發揮內皮保護作用，但具體的保護效應及機制尚未明確。為此，本研究自2018年4月至2019年4月以人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）為對象，分析了西格列汀對高糖誘導HUVECs凋亡的改善作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 細胞 HUVECs細胞株購自中科院上海細胞資源中心，在液氮中冷凍保存。

1.1.2 試劑 西格列汀購自默沙東公司，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制劑LY294002購自Sigma公司，TUNEL凋亡染色試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司，B細胞淋巴瘤∕白血病-2（Bcl-2）、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3、PI3K、AKT、人磷酸化磷酸肌醇3激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）的單克隆一抗購自Abcam公司。

1.1.3 儀器 熒光顯微鏡購自Nikon公司，化學顯影儀購自Bio-rad公司。

1.2方法

1.2.1 HUVECs培養、分組及給藥 HUVECs用含有10%胎牛血清、100 U∕mL青霉素、100 μg∕mL鏈霉素的DMEM進行貼壁培養，每2天更換1次培養液，細胞長至80%后用0.25%胰蛋白酶消化細胞，傳代接種在培養板內并分組。對照組用含有5.5 mmol∕L葡萄糖的DMEM處理，高糖組用含有33.3 mmol∕L葡萄糖的DMEM處理，西格列汀組在33.3 mmol∕L高糖的基礎上參照戴堯［3］的研究、用含有20 μmol∕L西格列汀的DMEM處理，西格列汀+LY組用含有33.3 mmol∕L 葡萄糖、20 μmol∕L西格列汀、10 μmol∕L LY294002的DMEM處理，每個條件設5個復孔，連續處理24 h。

1.2.2 HUVECs凋亡檢測 HUVECs接種在24孔板內，分組給藥24 h后用TUNEL試劑盒進行染色，抗熒光猝滅封固液封固后在熒光顯微鏡下觀察，對綠色熒光的細胞和藍色熒光的細胞進行計數，計算兩者比值為細胞凋亡率。

1.2.3 HUVECs中Bcl-2、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3、p-PI3K、p-AKT表達檢測 HUVECs接種在6孔板內，分組給藥24 h后用RIPA裂解液裂解細胞、提取蛋白，BCA試劑盒對蛋白進行定量后取30 μg蛋白樣本進行蛋白質印跡法（Western blot）檢測，將蛋白樣本加入SDS-PAGE中，電泳后電轉移至NC膜，用5%脫脂牛奶在室溫封閉NC膜1 h，用Bcl-2、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT的單克隆一抗在4℃孵育NC膜過夜。次日，用HRP標記的二抗在室溫孵育NC膜1 h，最后加入ECL顯影液、在化學顯影儀中顯影得到蛋白條帶，根據條帶的灰度值計算蛋白表達量。

1.3統計學方法采用SPSS 21.0軟件錄入數據，四組間計量資料的采用非參數檢驗（Kruskal-Wallis），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1西格列汀對高糖條件下HUVECs凋亡的影響與對照組比較，高糖組HUVECs的凋亡率明顯增加（P＜0.05）；與高糖組比較，西格列汀組HUVECs的凋亡率明顯減少（P＜0.05）；與西格列汀組比較，西格列汀+LY組的凋亡率明顯增加（P＜0.05）。見圖1。

2.2西格列汀對高糖條件下HUVECs中凋亡基因表達的影響與對照組比較，高糖組HUVECs中Bcl-2的蛋白表達量明顯減少，Cleaved-caspase-9、Cleavedcaspase-3的蛋白表達量明顯增加（P＜0.05）；與高糖組比較，西格列汀組HUVECs中Bcl-2的蛋白表達量明顯增加，Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3的蛋白表達量明顯減少（P＜0.05）；與西格列汀組比較，西格列汀+LY組HUVECs中Bcl-2的蛋白表達量明顯減少，Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3的蛋白表達量明顯增加（P＜0.05）。見圖2，表1。

2.3西格列汀對高糖條件下HUVECs中PI3K/AKT通路的影響與對照組比較，高糖組HUVECs中p-PI3K、p-AKT的蛋白表達量明顯減少（P＜0.05）；與高糖組比較，西格列汀組HUVECs中p-PI3K、p-AKT的蛋白表達量明顯增加（P＜0.05）；與西格列汀組比較，西格列汀+LY組HUVECs中p-PI3K、p-AKT的蛋白表達量明顯減少（P＜0.05）。見圖3，表2。

圖1 四組人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）凋亡率的比較（熒光染色×100）

圖2 四組人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中Bcl-2、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3的蛋白條帶

表1 四組人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中Bcl-2、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3蛋白表達的比較∕M（P25，P75）

圖3 四組人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中p-PI3K、p-AKT的蛋白條帶

表2 四組人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中p-PI3K、p-AKT蛋白表達的比較∕M（P25，P75）

3 討論

近年來，2型糖尿病的發病率呈不斷升高的趨勢，相應糖尿病并發癥的發病人數也不斷增多，嚴重危害國民的生命健康［5］。動脈粥樣硬化是糖尿病常見的血管并發癥，以動脈粥樣斑塊形成為基本特征，可增加心肌梗死、腦梗死等心腦血管疾病的發生風險。血管內皮細胞的損傷是造成動脈粥樣硬化發生的重要因素，糖尿病發生發展過程中內皮細胞的損傷與持續高糖環境的刺激有關［6］。多項研究證實，高糖條件能夠引起內皮細胞發生凋亡［7-9］，這也是高糖刺激內皮細胞損傷的可能途徑。本實驗以HUVECs為對象、用高糖條件刺激后得到了與既往其他報道一致的結果，即高糖組HUVECs的凋亡率明顯高于對照組。因此，抑制高糖誘導的HUVECs凋亡也被越來越多的學者視為防治糖尿病血管并發癥的靶點。

西格列汀是一類二肽基肽酶4抑制劑，通過抑制二肽基肽酶4對胰高血糖素樣肽-1的降解來增加體內胰高血糖素樣肽-1的水平，進而通過胰高血糖素樣肽-1的生物學活性來起到降糖作用。新近的多項研究報道，胰高血糖素樣肽-1具有內皮保護作用［10-11］；國內戴堯的研究證實，西格列汀能夠在高糖環境下增加內皮細胞中誘導型一氧化氮合酶的表達［4］，提示西格列汀可能也具有內皮保護作用。本實驗在高糖條件下用西格列汀對HUVECs進行干預，觀察凋亡率發現：西格列汀組HUVECs的凋亡率明顯低于高糖組，說明西格列汀能夠抑制高糖誘導的HUVECs凋亡、具有內皮細胞作用。

線粒體途徑凋亡是目前已知在高糖環節下與內皮細胞凋亡密切相關的凋亡機制，Bcl-2基因是調控該凋亡途徑的關鍵基因［12-13］。Bcl-2基因的編碼產物定位于線粒體外膜，能夠抑制線粒體內細胞色素C向細胞質的釋放；進入細胞質的細胞色素C能夠使pro-caspase-9裂解為有活性的cleaved-caspase-9，后者通過一系列級聯反應使pro-caspase-3裂解為有活性的cleaved-caspase-3、進而引起細胞凋亡。Bcl-2通過抑制細胞色素C的釋放來起到抗凋亡作用［14-15］。在本研究中，高糖刺激后HUVECs中Bcl-2的表達減少，cleaved-caspase-9及cleaved-caspase-3的表達增多；在用西格列汀處理后，HUVECs中Bcl-2的表達增多，cleaved-caspase-9及cleaved-caspase-3的表達減少，與細胞凋亡率的變化趨勢一致，進一步證實西格列汀能夠抑制高糖誘導的HUVECs凋亡。

在明確西格列汀對高糖誘導的HUVECs凋亡具有抑制作用后，本研究進一步分析了西格列汀發揮該作用的分子機制。PI3K∕AKT通路是具有促增殖、抗凋亡作用的信號通路，PI3K及AKT以磷酸化的形式發生活化后能夠調節下游Bcl-2、4EBP1等基因的表達，進而促進細胞增殖、抑制細胞凋亡［16-17］。本實驗的分析證實，高糖組細胞中p-PI3K、p-AKT的表達明顯減少，西格列汀干預后細胞中p-PI3K、p-AKT的表達明顯增加，說明西格列汀對HUVECs的PI3K∕AKT通路具有激活作用。在西格列汀干預的同時聯用PI3K的抑制劑LY294002后，西格列汀降低細胞凋亡率及cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3表達、增加Bcl-2表達的作用發生逆轉，由此證實西格列汀對HUVECs中PI3K∕AKT通路的激活介導了其抑制凋亡的效應。

綜上所述，西格列汀能夠抑制高糖誘導的內皮細胞凋亡且該作用與激活PI3K∕AKT通路有關，未來可設計臨床研究來觀察西格列汀對糖尿病病人動脈粥樣硬化的防治作用。