兩種酒精灌胃方案誘導(dǎo)大鼠酒精性肝損傷模型的比較研究*

胡 昊 李 寧 宋圓圓 王 博 龔志強(qiáng) 楊 艷

1 西南醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)，四川省瀘州市 646000； 2 西南醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫教研室

酒精性肝病是由于長(zhǎng)期大量飲酒而導(dǎo)致的肝臟損傷。隨著人們生活水平提高，酒精性肝病發(fā)病率逐年升高[1]，目前對(duì)酒精性肝損傷的研究主要集中于探討其致病經(jīng)歷、預(yù)防措施以及藥物治療的篩選[2-3]。穩(wěn)定可靠的酒精性肝損傷動(dòng)物模型是研究其致病機(jī)理和防治措施的基礎(chǔ)條件[4]。大鼠酒精性肝損傷模型同人類酒精性肝病發(fā)病機(jī)制相似，可為研究酒精性肝病發(fā)病機(jī)制提供幫助[5]。目前，國(guó)內(nèi)常用的酒精灌胃誘導(dǎo)酒精性肝損傷模型的方案主要有兩種：一種是類似黃玉軍等人以高度白酒或酒精以固定劑量持續(xù)灌胃2～8周誘導(dǎo)酒精性肝損傷模型的方法[6-7]，即固定酒精灌胃造模；另一種是屈勝勝等人用高度白酒或酒精持續(xù)灌胃6～12周造成大鼠酒精性肝損傷[8-10]，第1周或前幾周固定某一劑量(一般為6～8ml/kg)，以后每周或每幾周按某一劑量逐漸增加直至12～15ml/kg，即梯度酒精灌胃造模。但兩種模型的動(dòng)物存活情況以及肝損傷程度是否有差異尚不清楚。實(shí)驗(yàn)以大鼠的體重、存活情況以及肝損傷程度等作為指標(biāo)來(lái)比較固定酒精灌胃法和梯度酒精灌胃法誘導(dǎo)的酒精性肝損傷大鼠模型的差異，為后續(xù)對(duì)大鼠肝損傷分子機(jī)制和防治藥物的篩選提供簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物材料:SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體重180～200g，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(川)2018-17；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK(川)2018-065。

1.1.2 主要儀器與試劑:5810 R冷凍型臺(tái)式大容量高速離心機(jī)(德國(guó)eppendorf公司)；Versamax連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)分子儀器公司)；LD4-2A型臺(tái)式低速離心機(jī)(北京眾益中和生物技術(shù)有限公司)；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(中國(guó)常州國(guó)華電器有限公司)。56°紅星二鍋頭酒(北京紅星股份有限公司)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate transaminase，AST)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、總膽固醇(Serum total cholesterol，TC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酒精肝損傷大鼠模型建立:適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將40只SD大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組10只，兩灌胃造模組各15只。采用白酒56°紅星二鍋頭灌胃8周建立酒精性肝損傷大鼠模型，兩種灌胃方案為：一種固定10ml/kg的劑量灌胃，通過固定酒精灌胃造模，該組簡(jiǎn)稱固定組；一種以7ml/kg劑量灌胃為基礎(chǔ)，每2周按2ml/kg遞增，通過梯度酒精灌胃造模，該組簡(jiǎn)稱梯度組。兩組大鼠酒精平均劑量相等，總量相當(dāng)。大鼠每日灌胃1次。對(duì)照組用生理鹽水10ml/kg灌胃。

1.2.2 標(biāo)本采集、制備和指標(biāo)檢測(cè):末次灌胃后，禁食12h，用1%戊巴比妥鈉4ml/kg麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，取得的血液靜置1h，3 000r/min離心10min取血清。取血后立即處死大鼠，取肝臟用生理鹽水漂洗，濾紙拭干，迅速取部分肝組織，10%的福爾馬林液固定，包埋并切片，HE染色，光鏡下觀察。精確稱量肝組織塊制備10%的勻漿液，3 000r/min離心10min取上清液。按試劑盒說明書檢測(cè)血清ALT、AST、TG、TC和肝勻漿MDA、SOD。

2 結(jié)果

2.1 大鼠死亡情況 40只大鼠共有31只完成實(shí)驗(yàn)，建模成功21只。通過解剖死亡動(dòng)物來(lái)排除灌胃技術(shù)問題，則其余樣本死亡應(yīng)是動(dòng)物對(duì)酒精敏感引起。動(dòng)物死亡情況及原因分析見表1。梯度組大鼠酒精敏感死亡率為6.67%(1/15)，固定組大鼠酒精敏感死亡率為26.67%(4/15)。

表1 兩種灌胃方案的大鼠死亡情況及原因分析(n)

2.2 大鼠體重變化 各組大鼠體重變化情況見圖1。實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組大鼠體重持續(xù)增長(zhǎng)，梯度組大鼠體重第1～6周與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，前3周體重持續(xù)增長(zhǎng)，從第4周開始，增速緩慢，到第6周體重達(dá)到高峰，7、8周體重下降且顯著低于對(duì)照組大鼠(P<0.05)；固定組大鼠體重增長(zhǎng)緩慢，除第3周，各周體重顯著低于對(duì)照組大鼠(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)第1～5周，梯度組大鼠體重顯著高于固定組大鼠(P<0.05)，第6周至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，兩模型組大鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，兩模型組大鼠體重均顯著低于對(duì)照組(P<0.001)。

圖1 兩種灌胃方案誘導(dǎo)的大鼠模型體重變化

2.3 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化 光鏡下可見：對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)清晰，肝索排列整齊，呈放射狀，肝竇正常。梯度組和固定組大鼠肝小葉界限不清，肝細(xì)胞體積增大，輕微腫脹，胞質(zhì)疏松、淡染，核濃縮，出現(xiàn)彌漫性大小不等的脂肪空泡，兩模型組組織病理學(xué)變化程度無(wú)顯著差異。

2.4 各組大鼠血清ALT、AST、TG、TC的變化 兩模型組大鼠血清ALT、AST、TG、TC均高于對(duì)照組(P<0.05)。梯度組大鼠血清ALT、AST、TG、TC均高于固定組(P<0.05)，見表2。

表2 兩種灌胃方案誘導(dǎo)的大鼠模型血清ALT、AST、TG、TC變化

2.5 各組大鼠肝臟MDA、SOD的變化 兩模型組大鼠肝臟MDA均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，SOD均顯著低于對(duì)照組(P<0.001)。固定組大鼠肝臟MDA顯著低于梯度組(P<0.05)，SOD顯著高于梯度組(P<0.001)，見表3。

表3 兩種灌胃方案誘導(dǎo)的大鼠模型肝勻漿MDA、SOD變化

3 討論

酒精性肝損傷模型建立的方法多樣，模型效果也參差不齊[11]，到目前為止國(guó)內(nèi)尚未建立一種標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)大鼠酒精性肝損傷模型的方法。因?yàn)樵诮⒕凭愿螕p傷模型時(shí)，觀察指標(biāo)多為數(shù)個(gè)，在評(píng)價(jià)時(shí)還需對(duì)多因素、多指標(biāo)及其強(qiáng)弱進(jìn)行綜合評(píng)定，不斷改良模型，以期發(fā)現(xiàn)更理想的動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)以大鼠的體重、存活情況以及肝損傷程度等為指標(biāo)來(lái)比較固定酒精灌胃法和梯度酒精灌胃法誘導(dǎo)的酒精性肝損傷大鼠模型的差異，以篩選簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物模型造模方法。

實(shí)驗(yàn)利用兩種方案誘導(dǎo)大鼠酒精性肝損傷，造模8周，肝臟均出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹和脂肪組織沉積等病理變化，體重下降，大鼠血清ALT、AST活性及TG、TC 含量均顯著升高，肝臟MDA升高，SOD降低，這些都符合酒精性肝損傷的變化特點(diǎn)[12-14]，表明兩種方案造模的大鼠均出現(xiàn)明顯酒精性脂肪肝，肝組織發(fā)生氧化損傷。但與固定組比較，梯度組大鼠血清ALT、AST、TG、TC升高，肝臟MDA升高，SOD降低(P<0.05)，表明梯度酒精灌胃法建立的大鼠模型生化指標(biāo)變化更顯著。實(shí)驗(yàn)中，梯度組大鼠以7ml/kg、9ml/kg、11ml/kg白酒灌胃期間，體重與對(duì)照組無(wú)差異，以13ml/kg白酒灌胃時(shí)體重下降且顯著低于對(duì)照組；而固定組大鼠以10ml/kg白酒灌胃，第1周的體重顯著低于對(duì)照組，除第3周，各周體重顯著低于對(duì)照組。這說明酒精影響食欲、抑制體重增長(zhǎng)與酒精劑量有關(guān)，酒精達(dá)一定劑量才會(huì)影響食欲從而抑制大鼠體重，從體重變化圖可估計(jì)大鼠酒精性肝損傷的酒精閾劑量在9～11ml/kg之間。實(shí)驗(yàn)第7周至結(jié)束，固定組與梯度組大鼠體重均顯著低于對(duì)照組，但兩組間體重?zé)o差異，病理學(xué)改變也無(wú)差異，說明兩組大鼠灌胃方案不同，影響實(shí)驗(yàn)過程中的體重變化，酒精平均劑量相等且總量相當(dāng)，最終體重和病理學(xué)改變無(wú)差異。

酒精持續(xù)灌胃8周，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員灌胃技術(shù)要求高，同時(shí)由于大鼠對(duì)酒精的敏感度有個(gè)體差異，造模中往往因?yàn)楣辔讣夹g(shù)問題或大鼠酒精敏感度高而導(dǎo)致大鼠意外死亡。兩模型組共有9只大鼠死亡，通過死亡動(dòng)物解剖，發(fā)現(xiàn)4只是灌胃時(shí)酒精誤入氣管所致，5只可能是酒精敏感死亡所致(解剖發(fā)現(xiàn)肝臟明顯腫大，充血)。梯度組大鼠酒精敏感死亡率為6.67%，固定組為26.67%，固定組大鼠酒精敏感死亡率相對(duì)高，這與固定組酒精劑量始終高于大鼠酒精性肝損傷的閾劑量且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)有關(guān)。而梯度組大鼠生化指標(biāo)變化比固定組更顯著，也是由于后4周酒精劑量高于大鼠酒精性肝損傷的閾劑量，特別是最后2周13ml/kg酒精灌胃劑量遠(yuǎn)高于大鼠酒精性肝損傷的閾劑量，造成肝功能嚴(yán)重?fù)p傷。

梯度酒精灌胃方案誘導(dǎo)的酒精肝損傷大鼠模型體重增長(zhǎng)被抑制，血清ALT、AST 活性，TG、TC 含量，肝臟MDA顯著升高，肝臟SOD顯著下降，肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹和脂肪組織沉積等病理變化。相對(duì)固定酒精灌胃，梯度酒精灌胃大鼠酒精敏感的死亡率低，生化指標(biāo)變化更顯著，因此更適合用于酒精性肝病分子機(jī)制的研究和防治藥物的篩選。