間歇性低氧大鼠肺內TLR4的表達及影響

邱 丹 余 勤

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea, OSA)因睡眠期間上氣道反復塌陷，導致慢性間歇性低氧(intermittent hypoxia, IH)，并引發全身各個靶器官的損害。以多導睡眠圖監測過程中呼吸暫停低通氣指數(apnea-hypopnea index, AHI) ≥5為診斷標準，OSA在總體人群中的發生率為9%～38%，且隨著年齡的增長其發生率增加，男性發生率為10%～50%，女性發生率為3%～24%[1，2]。OSA發生的機制包括低氧誘導因子活化、循環炎癥標志物水平增加、氧化應激、內皮功能障礙、腎素-血管緊張素-醛固酮系統的激活及交感神經興奮性增高等。以上任何一種病理生理變化都可能導致不同器官、組織的病理改變，產生一系列并發癥[3，4]。

TLR4作為一種炎性介質，通過依賴MyD88和不依賴MyD88的途徑產生大量細胞因子和促炎性細胞因子，在先天性和適應性免疫中起關鍵作用。經典的信號轉導途徑是MyD88依賴性的，主要通過介導促炎性細胞因子的產生和NF-κB通路的活化觸發下游級聯反應，表達IL-6和TNF-α[5]。有研究表明，OSA患者單核細胞中TLR4表達顯著增加，TLR4在肺內的表達增加可能產生一系列改變，增加OSA合并肺氣腫、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、肺間質纖維化和肺癌及其他腫瘤發生的可能[6]。

材料與方法

1.實驗動物及分組:4～6周齡的SPF級健康雄性Wistar大鼠48只，體質量280～300g，購買于甘肅中醫藥大學動物中心，實驗動物許可證號為SCXKGan2013-0002，飼養于蘭州大學第一醫院實驗動物中心。實驗開始前在安靜、自然光照、溫度(20～25℃)及濕度適宜(45%～60%)的環境下使用同種水源、飼料及墊料飼養1周使大鼠適應實驗室環境。每日于統一時間投放標準飼料和滅菌水，實驗期間動物可在飼養倉內自由活動、自由飲食，無外界不良刺激和干擾。用數字表法將大鼠隨機分為4組(每組8只)，分別為A組(常氧組)、B組(輕度低氧組，即氧濃度為15%)、C組(中度低氧組，即氧濃度為9%)和D組(重度低氧組，即氧濃度為6%)。每日造模8h(9:00～17:00時)，連續造模35天。

2.儀器與試劑：(1)儀器：間歇性低氧裝置的組成為密閉大鼠飼養籠、氮氣/氧氣儲氣瓶程控儀、電磁式空氣壓縮機和控制系統。控制系統包括減壓閥、流量計、電磁閥及數字顯示時間繼電器等。CY-12C型測氧儀(浙江省建德市梅城電化學分析儀器廠)。氧氣和氮氣由甘肅省蘭州方圓建化有限責任公司供應。TKY-BMB攤片烤片機(湖北泰康醫療設備有限公司)。(2)試劑：羊抗TLR4兔抗體(成都正能生物產品公司)；山羊抗屬二抗；辣根標記酶； DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)；3%過氧化氫、二甲苯、無水乙醇及PBS緩沖液均由蘭州大學第一醫院病理科配制。

3.模型建立及實驗分組：參照文獻[7]的方法建立間歇性低氧的模型艙：低氧+復氧共120s為1個循環周期。首先開通壓縮氮氣30s，設定自動控制系統使間歇性低氧模型艙內的氧濃度由20%～21%迅速下降(其中A組下降至15%，B組下降至9%，C組下降至6%)，停止供氣10s使B、C、D艙內氧濃度分別維持在15%、9%和6%，隨后開通壓縮氧氣20s，使艙內的氧濃度在20s內迅速恢復至20%～21%，最后開通壓縮空氣60s維持艙內20%～21%的氧濃度。A組在飼養造模過程中持續輸入與其他組等流量的壓縮空氣，使實驗動物艙內的氧濃度維持在21%。過程中使用測氧儀實時監測艙內氧濃度。造模時間為8小時/天，共35天。其余時間所有大鼠均飼養于氧濃度為21%的適宜溫度及濕度的清潔室內環境。

4.取材:造模35天后，禁食12h，于第36天清晨稱重并記錄后以10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，無菌條件下在冰塊上快速解剖肺組織，留取右肺上葉并于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色和免疫組化。

5.組織病理學檢測:(1)HE染色：將固定后的大鼠右肺組織進行常規石蠟包埋，制作成4μm厚的切片，常規脫蠟后進行HE染色。(2)免疫組化：切片常規脫蠟后在烤片機上設定65～70℃烤片1h，常規使用二甲苯脫蠟，乙醇脫水，PBS緩沖液中浸泡5min，檸檬酸鹽中進行抗原修復，冷卻后于PBS浸泡5min，于3%過氧化氫浸泡10min，使用羊抗TLR4兔抗體用PBS液1∶50稀釋后于37℃恒溫箱中孵育 2h，使用DAB顯色劑顯色后常規脫水在光學顯微鏡下檢查組織樣品，使其透明，然后固定于載玻片上封片。隨機選取各組切片，每組分別5張，使用100倍鏡觀察肺組織內TLR4的表達情況，如果細胞膜或細胞質是棕色的，則確定結果為陽性，如果藍色則為陰性。每張切片選取14個視野采集圖像，根據染色面積和強度，應用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件對肺組織中的TLR4受體進行半定量分析，以此判斷大鼠肺組織中TLR4的表達情況。

結 果

1.肺組織HE染色病理切片結果：A組肺組織未見明顯異常，B、C、D這3組中肺間隔增寬，肺組織內均有淋巴細胞浸潤，其中B組可見少量巨噬細胞，無塵細胞，C組、D組中均可見塵細胞和巨噬細胞，且D組明顯多于C組；B、C、D這3組均有細支氣管黏膜上皮細胞的改變，其中D組可見肺間質的炎性細胞浸潤并伴有肺氣腫改變，部分肺泡擴張，肺泡間隔變窄并斷裂，相鄰肺泡融合成較大的囊腔，肺泡間隔內毛細血管床數量減少，小支氣管和細支氣管可見慢性炎癥改變，詳見圖1。

2.肺組織TLR4表達水平：在大鼠的肺組織中，TLR4主要表達于肺泡上皮細胞和氣管、支氣管黏膜上皮細胞的細胞膜和細胞質[8,9]。討論使用DAB染色后用免疫組化法檢測，TLR4于表達的細胞呈現棕黃色，與A組比較，B、C、D這3組大鼠肺組織的棕黃色染色更深,其中D組染色最深，B、C、D這3組中TLR4水平呈梯度表達，即D組TLR4表達水平最高，差異有統計學意義(P=0.000)。A、B、C、D 4組的大鼠肺組織TLR4陽性表達的平均吸光度分別為，A組0.2100±0.0246，B組0.2193±0.0317(P=0.000)，C組0.2584±0.0539(P=0.000)，D組0.3501±0.0656(P=0.000)，差異均有統計學意義，詳見圖2。

討 論

慢性間歇性缺氧(CIH)中缺氧-復氧變化是OSA的典型病理生理過程，在此過程中會產生許多活性氧(ROS)，從而使機體發生氧化應激，并降低低氧誘導因子(HIF-1)、NF-κB和激活素1(AP-1)的活性[10]。其中，NF-κB是重要的炎性反應起始因子，可在缺氧的情況下被激活，并隨著缺氧時間延長而增加。OSA促進NF-κB通路活化，使下游炎性介質和細胞因子如TNF-α、IL-6和IL-8等表達增加，導致炎癥和炎癥瀑布效應。TLR4作為一種炎性因子，一般由經典的MyD88依賴性通路激活，通過誘導促炎因子的產生和NF-κB通路的活化產生下游的相關炎性因子，CIH產生的一系列病理生理改變都共同促進這條炎癥通路的激活。TLR4在白細胞表達，能刺激誘導促炎性細胞因子和趨化因子產生，而人肺巨噬細胞(lung macrophages， LMs)是抵抗吸入病原體的第一道防線，刺激人類LMs中的TLR4會誘導細胞因子和趨化因子產生[11]。

TLR是跨膜蛋白，主要感應病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)，但也可以與損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns， DAMPs)結合誘導免疫反應，后者主要通過轉錄因子、炎性基因的修飾表達和細胞因子的產生來實現。TLR4位于細胞表面，能感知脂肽、鞭毛蛋白和脂多糖(LPS，革蘭陰性細菌的細胞壁成分)等外部的微生物成分，在人肺泡巨噬細胞(alveolar macrophages, AMs)中表達。TLR4信號轉導參與了早期的細胞因子反應，從而放大了炎癥并募集其他細胞來對抗入侵的微生物，巨噬細胞特別參與細胞因子的產生。激活TLR4后，AMs會釋放炎性因子，TLR4識別的吸入微生物可能會引起肺部感染等疾病。TLR刺激后產生的趨化因子大多涉及炎癥的發生，然后通過募集不同類型的細胞來維持炎癥，靶細胞類型與肺部疾病有關。

本研究中TLR4在不同程度的缺氧大鼠肺組織中表達不同，以間歇性缺氧程度最重的D組大鼠中表達最豐富，結合其他研究，本研究驗證了TLR4表達水平隨著缺氧程度的加重而增加的這一結論。但本研究除了驗證間歇性缺氧使肺組織TLR4的表達增加外，還要討論TLR4表達的增加對肺以及其他器官產生的可能影響。

TLR4通過促進內皮細胞抗氧化的防御作用而在肺穩態中起著關鍵作用。TLR4缺陷可導致動物出現肺氣腫，這可能與氧化及抗氧化的失衡有關，TLR4表達的差異與COPD的進展有關，在人類的肺氣腫中，減少TLR4的表達與更嚴重的肺氣腫和氣道阻塞有關。為了驗證TLR4表達的差異是否與肺氣腫或氣流受限有關，有研究者用實驗驗證TLR4與肺氣腫嚴重性的相關性，結果表明，隨著TLR4表達增加，FEV1/FVC增加，肺氣腫評分降低。隨著TLR4表達水平的降低，氣流限制也變得更加嚴重。在TLR4缺陷小鼠的上皮細胞中，自噬蛋白LC3B的表達和反應香煙煙霧暴露的凋亡細胞的標志物增加[12]。總之，吸煙者肺中TLR4表達下調與肺氣腫和氣流受限有關，TLR4在煙霧誘導的肺氣腫形成中起保護作用。但是，本實驗并無吸煙的干預條件，因此隨著缺氧程度的加重，TLR4表達增加，肺氣腫的病理變化反而加重，因此還需要進一步研究來闡明TLR4表達下調與肺氣腫之間的因果關系以及吸煙在其中的作用。

TLR4通過衰老相關基因表達的表觀遺傳調控，在維持肺的動態平衡中發揮了新的作用。Huang等[13]研究證實內皮細胞TLR4通過HDAC2-組蛋白H4-p16INK4a抑制細胞衰老，是通過HDAC2介導的組蛋白H4去乙酰化抑制內源性p16INK4a表達，從而發現了此前未被認識到的TLR4在預防衰老相關基因p16INK4a表達中的作用。肺內皮細胞p16INK4a的沉默阻止TLR4-/-誘導肺氣腫，揭示p16INK4a在肺中的新功能作用。基于免疫組化的TLR4表達差異在支氣管和肺泡上皮細胞中最明顯，TLR4的免疫組織化學染色顯示支氣管和肺泡上皮細胞是顯示TLR4表達差異的主要細胞。肺泡巨噬細胞在所有患者中均表現出較高的TLR4表達，因此對各組間的表達差異無貢獻，但是，本實驗中每組大鼠的TLR4表達均以巨噬細胞為主，且不同缺氧條件下的表達量差異有統計學意義(P<0.05)，因此，本實驗仍以巨噬細胞表達的TLR4作為討論的基礎，由于重度缺氧組的肺泡上皮細胞未觀察到有明顯的TLR4的表達，所以是否可以認為是導致肺氣腫發生的原因仍需進一步加以驗證，但可以明確的是TLR4通過促進內皮細胞抗氧化劑的防御作用而在肺穩態中起著關鍵作用[14]。

TLR4在多種細胞和腫瘤組織中表達，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃腸腫瘤、肝癌和膀胱癌[15]。有研究者發現，TLR4在正常細胞發揮防御作用，在癌細胞起負性作用。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K/Akt)信號轉導途徑是各種免疫應答和炎癥過程的經典介質, 腫瘤微環境中PI3K/Akt信號通路可能是一種潛在有效的對抗措施。有實驗證明，革蘭陰性大腸桿菌肺炎可通過宿主TLR4激活增強NSCLC轉移，并且部分地通過上皮細胞TLR4激活和IL-6釋放而得到促進。因此，TLR4是針對革蘭陰性菌肺炎增加NSCLC轉移的潛在治療靶標[16]。TLR4抗體、抑制劑或拮抗劑可能會影響乙酰化、二聚作用或TLR4配體/受體的識別，這可能會抑制下游信號的激活，表明這是一種通過靶向TLR4信號進行肺炎治療的策略[17]。研究還發現TLR4和MyD88與腫瘤進展及腫瘤對化療藥物(如紫杉醇)的耐藥性相關。近年來研究表明，幾乎所有TLR都參與了增加的癌癥發生率、疾病嚴重程度和不良預后，因此可以用作預防癌癥方法的靶點53～55[15]。

TLR4是跨膜蛋白，屬于模式識別受體家族, 它的激活導致NF-κB的表達增加，從而增加促炎性細胞因子的產生，促炎性細胞因子負責激活先天免疫系統，后者在博來霉素誘導的肺纖維化的發病機制中起作用。此外，TLR4通過增加α-SMA和Ⅰ型膠原的表達并隨后發生纖維化而促進博來霉素誘導的肺損傷中的纖維化。TLR4作為病原體模式識別受體，在調節細胞免疫功能，維持肺泡上皮的穩定性以及炎癥后的重建中具有保護作用。但是，在某些病理狀態下TLR4的過度表達和激活可能導致不受控制的炎癥和纖維化。因此，不同病理狀態下TLR4表達的調控機制以及防止TLR4過表達的手段是進一步研究的重要方向。PI3K-Akt是 ALI的早期啟動肺纖維化的途徑之一。通過用TLR4-shRNA慢病毒轉染抑制TLR4表達，可以在ALI早期抑制纖維化過程。因此，這種治療可能會降低LPS誘導的ALI的嚴重程度和肺纖維化，從而改善疾病的預后。研究表明，單寧酸(tannic acid, TA)可能直接結合TLR4，從而抑制LPS與TLR4/MD2復合物的結合以及隨后的信號轉導，在炎癥介導的疾病(包括纖維化)中有治療作用[18]。

TLR4對機體的其他影響：由于TLR4促進慢性間歇性缺氧誘導的肺部炎癥，而TLR拮抗劑TAK242可減輕CIH誘導的肺損傷和炎性反應，因此能作為一種治療手段應用于臨床[6]。

綜上所述，慢性間歇性低氧通過模擬OSA過程，造成大鼠肺部的炎癥，并使肺組織內TLR4的表達增加，且表達量與缺氧程度呈正相關。TLR4作為一個炎性指標，通過MyD88/TLR4/NF-κB通路激活炎癥表達，釋放炎性因子，可觸發一系列肺部疾病，且TLR4表達水平的差異可影響肺部原有疾病的進展，因此，TLR4可作為疾病治療的靶標，為相關疾病的治療提供新的思路。