circRNA-ITCH通過TET1基因抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

常昆鵬 魏珍星 李 斐 張 煒

鼻咽癌是我國最常見的耳鼻咽喉部位的惡性腫瘤，具有明顯的地理分布特征，我國是鼻咽癌的高發(fā)國[1]。鼻咽癌的治療多采用放射治療，放射治療后可對(duì)殘余癌灶行手術(shù)切除[2]。然而由于解剖位置較隱蔽，鼻咽癌早期不易發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致很多患者確診時(shí)已發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后不良[3,4]。明確鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找早期診斷和轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，對(duì)改善鼻咽癌患者的預(yù)后有重要意義。環(huán)狀非編碼RNA(circRNA)是一種內(nèi)源性、非編碼RNA，由外顯子和(或)內(nèi)含子選擇性剪切形成的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)[5]。circRNA由于不含3′端和5′端，因而很難被外切核酸酶降解，具有很高的穩(wěn)定性[6]。近年來，circRNA已被證明在多種腫瘤中異常表達(dá)，廣泛參與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、侵襲、凋亡等惡性生物學(xué)行為[7]。circRNA-ITCH是近年來新發(fā)現(xiàn)的circRNA，其在膀胱癌、卵巢癌、肺癌等腫瘤中表達(dá)明顯降低，上調(diào)其表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，具有明顯的抑癌基因作用[8～10]。circRNA-ITCH在鼻咽癌中的表達(dá)和作用機(jī)制研究尚未報(bào)道。本研究通過檢測(cè)鼻咽癌組織和細(xì)胞系中circRNA-ITCH的表達(dá)水平, 進(jìn)一步分析過表達(dá)circRNA-ITCH影響鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制。

材料與方法

1.材料：(1)組織標(biāo)本：收集2016年9月～2019年5月筆者醫(yī)院耳鼻喉科49例鼻咽癌及癌旁組織標(biāo)本，其中男性28例，女性21例，患者年齡31～65歲，平均年齡49.72±12.15歲。根據(jù)2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)頭頸腫瘤臨床分期對(duì)鼻咽癌臨床分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期12例，Ⅲ期26例，Ⅳ期6例。鼻咽癌標(biāo)本根據(jù)世界衛(wèi)生組織鼻咽癌組織學(xué)分類確定病理診斷：角化性鱗狀細(xì)胞癌33例，非角化性癌16例。所有患者在標(biāo)本收集時(shí)均未接受放療、化療，本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。(2)細(xì)胞系和主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基、K-SFM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司。鼻咽癌細(xì)胞系(HNE-1、CNE-2Z、C666-1、SUNE-1、HONE-1)和人永生化鼻咽上皮細(xì)胞(NP69)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。攜有無意義序列的陰性對(duì)照質(zhì)粒和攜有circRNA-ITCH的質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥有限公司。qPCR試劑盒購自美國Roche公司。LipofectamineTM2000和Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。Transwell小室購自美國Corning公司。GAPDH、TET1、Wnt1、PLC、PKC和β-catenin蛋白抗體購自英國Abcam公司。CCK-8試劑盒購自美國Sigma公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：人永生化鼻咽上皮細(xì)胞(NP69)接種于K-SFM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基，鼻咽癌細(xì)胞系(HNE-1、CNE-2Z、C666-1、SUNE-1、HONE-1)接種于RPMI 1640(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待CNE-2Z細(xì)胞穩(wěn)定傳代后，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板，接種密度以轉(zhuǎn)讓時(shí)融合度達(dá)60%為準(zhǔn)。根據(jù)LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基配制轉(zhuǎn)染體系，分別向CNE-2Z細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒和攜有circRNA-ITCH的質(zhì)粒，分別定義為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染8h后，更換為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。

3.qPCR檢測(cè)組織或細(xì)胞中circRNA-ITCH、TET1 mRNA的表達(dá)：分別提取組織或細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)后，取500ng總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR反應(yīng)總體系為20μl。circRNA-ITCH上游引物序列：5′-AGCAATGCAGCAGTTT-3′，下游引物序列：5′-TGTAGCCCATCAAGACA-3′，產(chǎn)物片斷197bp。TET1上游引物序列：5′-TGTAGCCCATCAAGACA-3′， 下游引物序列：5′-TGTAGCCCATCAAGACA-3′，產(chǎn)物片斷265bp。以GAPDH為管家基因，GAPDH上游引物序列：5′-TGTAGCCCATCAAGACA-3′， 下游引物序列：5′-TGTAGCCCATCAAGACA-3′，產(chǎn)物片斷265bp。qPCR反應(yīng)條件：94℃ 5min，94℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 20s，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt法計(jì)算circRNA-ITCH、TET1 mRNA的相對(duì)表達(dá)。

4.CCK-8法檢測(cè)CNE-2Z細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染后48h的兩組細(xì)胞消化、重懸，分別以3000個(gè)/孔接種于96孔板，細(xì)胞懸液體積為200μl。CCK-8檢測(cè)時(shí)，加入15微升/孔 CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h，消除孔內(nèi)氣泡，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在450nm波長處的吸光度值，分別于接種后1、2、3、4、5天行CCK-8法檢測(cè)。

5.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE-2Z細(xì)胞侵襲：按1∶10的比例將RPMI 1640培養(yǎng)基與Matrigel基質(zhì)膠充分混合，分別在每個(gè)Transwell小室上室加入100μl混合物，于培養(yǎng)箱中充分凝固。將轉(zhuǎn)染后48h的兩組細(xì)胞消化，用無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，分別在每個(gè)Transwell小室上室加入200μl細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為1×105個(gè)/毫升)，分別在每個(gè)Transwell小室下室加入600μl含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)24h，取出Transwell小室上室，無水乙醇固定10min，0.1%結(jié)晶紫染色染色10min，流水漂洗、晾干后，于顯微鏡下計(jì)數(shù)。

6.Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞TET1及下游蛋白的表達(dá)：將轉(zhuǎn)染后48h的兩組細(xì)胞消化、離心，采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，每組按40μg蛋白上樣量進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠(濃度為10%)電泳2h，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜2h，采用5%脫脂奶粉封閉3h，分別與一抗GAPDH(1∶3000稀釋)、TET1(1∶1000稀釋)、Wnt1(1∶2000稀釋)、PLC(1∶2000稀釋)、PKC(1∶2000稀釋)和β-catenin(1∶1000稀釋)在4℃下孵育過夜。洗膜后，與二抗(1∶10000稀釋)在室溫下孵育2h后，均勻滴加化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)掃描、拍照，比較目的蛋白表達(dá)。

結(jié) 果

1.circRNA-ITCH在鼻咽癌組織和癌旁組織中的表達(dá)：與癌旁組織比較(圖1)，circRNA-ITCH在鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。

2.circRNA-ITCH在正常肝細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞系的表達(dá)：與人永生化鼻咽上皮細(xì)胞(NP69)比較(圖2)，circRNA-ITCH在鼻咽癌細(xì)胞系(HNE-1、CNE-2Z、C666-1、SUNE-1、HONE-1)中表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，CNE-2Z細(xì)胞中circRNA-ITCH的表達(dá)量最低(P<0.01)。

3.檢測(cè)circRNA-ITCH質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組CNE-2Z細(xì)胞中circRNA-ITCH相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.02和8.09±1.12(t=6.34，P<0.01)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。

4.過表達(dá)circRNA-ITCH對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響：CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的CNE-2Z細(xì)胞從第2天開始，增殖能力降低(P<0.05,圖3)。

5.過表達(dá)circRNA-ITCH對(duì)CNE-2Z細(xì)胞侵襲的影響：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組CNE-2Z細(xì)胞侵襲細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為80.17±7.64個(gè)和39.12±6.57個(gè)(P<0.01)。與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染circRNA-ITCH后的鼻咽癌細(xì)胞侵襲能力被抑制(圖4)。

6.兩組細(xì)胞中TET1 mRNA的表達(dá)：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組CNE-2Z細(xì)胞中TET1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.04和5.03±0.50(t=7.98，P<0.01)。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中TET1 mRNA的表達(dá)增加。

7.過表達(dá)circRNA-ITCH對(duì)TET1蛋白及Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響：Western blot法結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，過表達(dá)circRNA-ITCH后，TET1蛋白表達(dá)明顯增加，Wnt1、PLC、PKC和β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低(圖5)。

討 論

circRNA主要位于細(xì)胞質(zhì)，是一種由共價(jià)鍵形成的閉合環(huán)狀RNA分子，結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，可通過多種方式影響目的基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的生命活動(dòng)[11]。近年來，不斷有新的circRNA如HIPK3、LARP4、ZNF609被證實(shí)在鼻咽癌中異常表達(dá)，參與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展[12～14]。circRNA-ITCH是一種新發(fā)現(xiàn)的circRNA，Yang等[15]研究顯示，circRNA-ITCH在膀胱癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，且circRNA-ITCH的表達(dá)水平越低，膀胱癌患者的生存期越短；過表達(dá)circRNA-ITCH可通過吸附miR-17和miR-224，抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Luo等[16]研究顯示，circRNA-ITCH在卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)降低，上調(diào)circRNA-ITCH可干擾miR-10a的表達(dá)，抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。circRNA-ITCH可發(fā)揮明顯的抑癌基因作用，然而其在鼻咽癌中的作用及機(jī)制尚不明確。

本研究結(jié)果顯示，circRNA-ITCH在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，表明circRNA-ITCH可能在鼻咽癌的發(fā)病過程中起到重要作用。CCK-8法和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)circRNA-ITCH可明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。10-11轉(zhuǎn)位酶1(TET1)TET蛋白是體內(nèi)存在的一種DNA去甲基化酶，可促進(jìn)5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶，啟動(dòng)基因的去甲基化[17]。目前研究表明， TET1在鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌及卵巢癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)明顯降低，與腫瘤直徑、腫瘤生長、腫瘤侵襲、臨床分期等因素相關(guān)，TET1表達(dá)水平與腫瘤患者的預(yù)后有關(guān)，其表達(dá)越低，患者預(yù)后越差[18～20]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)circRNA-ITCH的CNE-2Z細(xì)胞中TET1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)明顯增加，表明circRNA-ITCH具有TET1基因的表達(dá)。有研究表明，TET1蛋白主要通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，發(fā)揮抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。本研究結(jié)果顯示，TET1表達(dá)明顯增加后，Wnt1、PLC、PKC和β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低，表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路被抑制。

綜上所述，circRNA-ITCH在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)明顯降低，過表達(dá)circRNA-ITCH可明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲，其作用機(jī)制是促進(jìn)TET1基因的表達(dá)，進(jìn)一步抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化。circRNA-ITCH在鼻咽癌中表現(xiàn)為抑癌基因的作用，為鼻咽癌生物靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。