芍藥醇對結腸炎小鼠Foxp3表達的影響及其機制研究

柯樂斌 高仁賢 周垂楊

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC) 是一種慢性非特異性的腸道炎癥，屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD) 的一種，病變以結腸黏膜層的潰瘍為主，潰瘍嚴重者可侵及全結腸，其病程長且難以治愈，發生率逐年上升，本疾病的發病機制尚未完全明確，目前大量研究表明其發病與免疫調節平衡和腸道免疫密切相關[1～3]。Treg 細胞來源于CD4+Treg，由Foxp3誘導產生，能下調自身免疫應答來誘導自身免疫耐受和抑制自身免疫疾病的發生，有預防、減弱或終止各種炎性反應促使慢性炎癥愈合的功能; 在抑制免疫反應、介導免疫耐受等過程中起著重要的作用[4, 5]。近年來研究表明，Th17/Treg 轉化平衡是維持腸道免疫穩態的重要因素，Th17/Treg的失衡與UC關系密切[6]?；謴驼{整體內Th17/Treg的平衡在IBD動物模型和臨床療效中都不斷地得到驗證[7,8]。因此，以Th17和Treg細胞相互轉化為靶點，研究具有抑制炎癥作用的化合物將為潰瘍性結腸炎的治療提供新的思路。

芍藥醇是從傳統中草藥例如牡丹皮、白芍根和野山藥中提取的一種有效成分，廣泛參與免疫調節，抗炎、抗腫瘤和抗氧化等生理過程。研究表明在肝細胞癌大鼠模型中，芍藥醇能有效提高肝抗氧化酶的生成和免疫調節因子表達[9]。另有研究顯示在卵清蛋白誘導的哮喘小鼠模型中，芍藥醇抑制TLR4/NF-κB和MAPK信號通路緩解哮喘引起的炎性細胞浸潤和膠原沉積[10]。芍藥醇被證明可以通過靶向調節T-LAK細胞起源的蛋白激酶來抑制日光紫外線誘導的皮膚炎癥[11]。本研究誘導小鼠潰瘍性結腸炎模型，觀察芍藥醇對于模型小鼠的保護作用，并探究其內在機制，為芍藥醇在潰瘍性結腸炎中的治療可行性提供科學依據。

材料與方法

1.實驗動物與試劑:30只健康雄性BALB/c小鼠[SPF級,浙江中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物許可證號為SYXK(浙)2010-0012]，體質量為20±2g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心在SPF條件下飼養繁殖，動物飼養及實驗操作嚴格遵守實驗動物的使用和管理原則。葡聚糖硫酸鈉(DSS)(美國MP Biomedicals公司，批號160110)，芍藥醇(中國成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：552-41-0，規格：20mg)，Foxp3(英國Abcam公司，ab215206),RORγt(美國Santa Cruz公司，sc-293150)，細胞因子ELISA檢測試劑盒IL-17(美國R&D Systems公司，DY421-05)，IL-6(美國R&D Systems公司，SM6000B)，IL-10(美國R&D Systems公司，DY417-05)，TGF-β(美國R&D Systems公司，7666-MB-005)，流式熒光抗體染料：PE-Hamster Anti-Mouse-CD3(貨號：14-0031-82)、PE-Hamster Anti-Mouse CD25(貨號：12-0251-82)、FITC Rat Anti-Mouse CD4(貨號：11-0041-82)、APC Rat Antimouse IL-17A(貨號：17-7177-81)、APC Rat Anti-Mouse Foxp3(貨號：17-5773-82)均購自美國eBioscience公司。

2.動物分組及UC模型小鼠制備:30只健康雄性BALB/c小鼠按照數字表法隨機分成空白對照組、UC模型組、芍藥醇治療組3組，每組小鼠均為10只。使用自由飲用2% DSS水溶液建立UC小鼠模型，除空白對照組外其余兩組均用2% DSS水溶液代替(DSS水溶液每天新鮮配置)，造模周期14天。芍藥醇治療組：造模1周后，治療組小鼠每天給予灌胃2ml芍藥醇；UC模型組：造模1周后，每天灌胃2ml蒸餾水。造模期間每天觀察小鼠飲食、毛發、一般活動狀態等，出現稀便、腹瀉、大便隱血或肉眼血便的任1個癥狀即判定為模型建立成功。

3.疾病活動指數(DAI)評分：芍藥醇灌胃治療開始后，每天稱小鼠體質量，并取各小鼠糞便，觀察大便性狀，糞便隱血試劑盒(鄰甲苯胺法)測定大便隱血分數，評估疾病活動指數(DAI)，DAI=(體質量下降分數+大便性狀分數+大便隱血分數)/3，詳見表1。

表1 疾病活動指數DAI評分

4.ELISA檢測外周血清相關因子含量：小鼠在芍藥醇治療結束后，用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，抽取小鼠外周靜脈血，室溫靜置3h后放入4℃預冷的離心機中離心3000r/min，30min，調整為soft模式，收集上層血清。按照ELISA檢測試劑盒說明書檢測血清中IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β的含量。

5.流式細胞儀檢測外周血Treg/Th17細胞比例:采集小鼠外周血置于兩個肝素鈉真空抗凝管中，加入CD3/CD4/CD25抗體各10μl，室溫避光孵育20min；400×g離心5min，去上清，清洗；加入IC Fixation buffer 100μl，混勻，避光孵育40min，加入Permeabilization buffer 2000μl，400×g離心5min，去上清；加IL-17A抗體5μl，混勻，室溫避光孵育4min；加300μl的PBS，渦旋，避光存放，上機檢測。Treg細胞檢測方法相同，采用CD3/CD4/CD25/Foxp3抗體標記。

6.小鼠結腸組織損傷指數(CMDI)評分:小鼠采血后立即處死，剪取距肛門約8cm的腸道，用4%多聚甲醛固定結腸標本，放大鏡下觀察小鼠鼠結腸黏膜的損傷程度，評估小鼠結腸組織損傷指數(CMDI)，詳見表2。

表2 結腸組織損傷指數(CMDI)評分標準

7.小鼠結腸病理組織學指數(CHPI)評分:小鼠新鮮結腸組織PBS沖洗后于4%甲醛溶液中固定24h以上，脫水、包埋并制成2μm切片，每只小鼠隨機選取3張切片。按照HE染色的流程進行處理。制好的小鼠結腸HE切片與顯微鏡下觀察并按照表3的評分標準評估小鼠結腸病理學組織指數(CHPI)。

表3 結腸病理組織學指數(CHPI)評分

8.小鼠結腸Foxp3、RORγt mRNA水平檢測:取小鼠結腸組織，液氮研磨成粉末，Trizol法提取組織總RNA，用反轉錄試劑盒反轉為cDNA，以cDNA為模板加入合成的引物進行real-time PCR檢測。兩步法PCR反應條件：預變性，95℃ 30s，PCR反應，95℃ 5s，95℃ 30s，60℃ 30s，40個循環；解離，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。引物信息：RORγt：上游引物:5′-GCCTACAATGCCAACAACCA-3′，下游引物：5′-GGACGGTTGGCATTGATGAG-3′；Foxp3：上游引物：5′-ACTCGCATGTTCGCCTACTT-3′，下游引物：5′-AGGGATTGGAGCACTTGTTG-3′；內參GAPDH：上游引物：5′-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3′，下游引物：5′-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3′。記錄每次測定的Ct值，取3個副孔的平均值，以GAPDH為內參照，得出的數據用2-△△Ct進行分析。

9.小鼠結腸Foxp3、RORγt 蛋白水平檢測:提取小鼠結腸組織蛋白，BCA法進行蛋白定量，蛋白變性，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，聚偏二氟乙烯膜(PVDF)蛋白轉膜，5%脫脂牛奶常溫封閉1h，一抗濃度Foxp3(1∶1000)、RORγt(1∶1000)、β-actin (1∶10000)用牛奶稀釋，4℃孵育過夜，洗膜液洗3次，每次10min，二抗濃度(1∶10000)孵育1.5h，洗膜液洗3次，每次10min，化學發光法(ECL)顯影，凝膠成像系統檢測Foxp3和RORγt蛋白表達，以β-actin為內參。

結 果

1.各組小鼠癥狀及結腸組織學改變比較:與空白對照組比較，UC模型組小鼠出現精神差，活動量少，進食、飲水量減少，體重減輕等癥狀，同時出現稀便甚至水樣便和肉眼血便，DAI評分顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，芍藥醇治療組小鼠癥狀得到緩解，精神趨于正常，進食和活動恢復，糞便正常，未見膿血便，DAI評分明顯降低(P<0.05)。與空白對照組比較，UC模型組小鼠結腸組織上有多處潰瘍，并且面積>1cm2，DSS誘導潰瘍性結腸炎模型成功。芍藥醇治療組小鼠結腸組織潰瘍有所緩解，光鏡下未發現明顯的炎癥。小鼠結腸HE染色結果顯示，空白對照組小鼠結腸組織結構完整，腺體明顯，未見萎縮、壞死、變性及炎性細胞浸潤等現象。與空白對照組比較，UC模型組小鼠具有典型的潰瘍性結腸炎病理變化。結腸組織結構破壞，出現潰瘍，腺樣異常，不典型增生，并伴有大量炎性細胞浸潤，隱窩數量明顯減少，CHPI顯著增加(P<0.05)。與模型組比較，芍藥醇治療組小鼠隱窩炎癥減輕，炎性細胞浸潤程度輕，CHPI明顯降低(P<0.05)。HE染色結果詳見圖1，各組小鼠DAI、CMDI、CHPI評分結果詳見表4。

表4 各組小鼠DAI、CMDI和CHPI評分結果

2.小鼠外周血清IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β水平：ELISA檢測3組小鼠外周血清相關因子水平，檢測結果顯示，與空白對照組比較，UC模型組小鼠血清中IL-17和IL-6水平顯著升高，IL-10和TGF-β水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與UC模型組比較，芍藥醇治療組小鼠血清中IL-17和IL-6水平顯著下降，IL-10和TGF-β水平明顯回升，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表5。

表5 各組小鼠血清IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β水平

與空白對照組比較，*P<0.01；與UC模型組比較，#P<0.01

3.小鼠外周血Treg/Th17細胞占比結果比較：利用流式細胞儀檢測不同處理組小鼠外周血中Treg/Th17細胞占比數值，與空白對照組比較，UC模型組小鼠Th17 細胞的百分比明顯增加，Treg細胞的百分比相應減少，差異有統計學意義(P<0.05)；與UC模型組比較，芍藥醇治療組小鼠外周血中Th17細胞的百分比相對減少，Treg細胞的百分比相應增加，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表6。

表6 小鼠外周血Th17、Treg細胞占CD4 +T 細胞百分比結果

4.小鼠結腸Foxp3、RORγt mRNA水平檢測:realt-ime PCR結果顯示，與空白對照組比較，UC模型組小鼠Foxp3 mRNA表達水平降低，RORγt表達增加，差異有統計學意義(P<0.05)。與UC模型組比較，芍藥治療組小鼠結腸組織Foxp3表達得到恢復，而RORγt表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表7。

表7 小鼠結腸組織Foxp3、RORγt mRNA水平檢測結果

5.小鼠結腸Foxp3、RORγt 蛋白水平檢測:UC模型組小鼠結腸中Foxp3蛋白表達顯著降低，而RORγt蛋白表達明顯增加。與UC模型組比較，芍藥醇治療組小鼠結腸中Foxp3蛋白表達有所增加，而RORγt蛋白表達下降，結果與mRNA檢測結果一致，詳見圖2。

討 論

Th細胞是T淋巴細胞中一個十分重要的亞群，Th細胞平衡失常與炎癥的發生和發展關系密切[12, 13]。Th17和Treg細胞均來自CD4+T 細胞，在外周血或脾中循環。Th17細胞作為最重要的促炎細胞，特異性分泌白介素17(IL-17)和白介素6(IL-6)并促進炎性反應，本研究中UC模型組小鼠外周血清中IL-17和IL-6水平明顯上升，說明了炎性反應的存在。而Treg 細胞作為具有獨特調節作用的免疫抑制細胞，主要分泌一些細胞因子如白介素-10(IL-10)和轉化生長因子-β(TGF-β)，在無促炎細胞因子的情況下，TGF-β誘導CD4+T 細胞分化成Treg細胞，Treg細胞產生抗炎細胞因子IL-10 和TGF-β，抑制T細胞的活性和增殖，控制免疫應答的強度，減輕機體組織的損傷[14，15]。本研究結果顯示，在UC模型組小鼠外周血清中，IL-17和IL-6等炎性因子表達水平上升，IL-10和TGF-β水平顯著下降。

大量研究表明，Th17和Treg細胞失衡是導致風濕性關節炎、哮喘和IBD等多種免疫性疾病的重要原因[4, 16, 17]。通過檢測小鼠外周血Th17、Treg細胞占CD4+T 細胞百分比結果，本研究中UC模型組小鼠體內存在Th17和Treg細胞失衡的現象，提示疾病發生可能與免疫細胞數量失衡相關。Foxp3是控制Treg細胞分化的特異性轉錄因子，CD4+CD25+Treg細胞分化過程中呈特異性高表達，可調控Treg細胞分化發育和功能，該基因突變或敲除小鼠會導致CD4+CD25+Treg細胞缺失或下降，伴有功能缺陷，誘發嚴重自身免疫反應[18]。研究表明表達Foxp3的Treg細胞在SCID小鼠模型中可以抵抗結腸炎的能力，同時其喪失活力也會引起小鼠炎性腸病的發生[19]。在緩解期UC患者腸黏膜固有層的Foxp3+Tregs細胞數量明顯增加, 研究認為這些增加的細胞在選擇性抑制效應T細胞的反應和維持腸道免疫平衡中可能起著重要作用[20]。本研究中小鼠結腸組織蛋白檢測結果顯示，UC模型組小鼠結腸內Foxp3蛋白明顯下降，而在芍藥醇治療組小鼠結腸組織內Foxp3蛋白表達則有所回升，這與既往研究結果相符合，Foxp3蛋白增加可以緩解潰瘍性結腸炎。

綜上所述，本研究著重探討了芍藥醇在潰瘍性結腸炎小鼠的作用及其內在機制。研究結果證實了芍藥醇可以促進潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中Foxp3表達，誘導Treg細胞分化生成，降低RORγt表達，抑制Th17細胞分化，調節Th17/Treg細胞平衡，維持體內免疫平衡，同時降低IL-17、IL-6炎性相關因子的表達，減輕腸道炎性反應，從而起到緩解和治療潰瘍性結腸炎的作用，為今后的臨床應用提供了科學依據。本研究也發現Foxp3的表達在IBD進展過程中可以調控免疫細胞的分化和數量平衡，圍繞Foxp3在炎性腸病分子生物學機制研究的深入，對于IBD的發病機制和診治策略將提供新的認識。