不同地區妊娠期女性葉酸代謝障礙風險及其相關基因多態性的研究

王 玲 梁 雄

圍孕期葉酸缺乏可導致妊娠期貧血、妊娠期高血壓疾病、死胎、新生兒神經管缺陷、唇腭裂、新生兒先天性心臟病、自閉癥等不良妊娠結局的發生[1]。葉酸代謝障礙是導致妊娠期女性體內葉酸缺乏的重要因素之一，其中亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)及甲硫氨酸合酶還原酶(methionine synthase reductase,MTRR)是葉酸代謝通路中的關鍵酶，其基因多態性與葉酸代謝障礙息息相關。我國葉酸代謝水平在不同地域女性中分布的差異性缺乏大樣本的研究。本研究通過對1415例妊娠期女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G 的基因型檢測，獲取葉酸代謝關鍵酶基因多態性，分析部分妊娠期女性葉酸代謝基因的分布特征，為進一步的群體遺傳分析奠定基礎，給予不同地域圍孕期女性的葉酸補充提供依據。

對象與方法

1.研究對象：選擇2018年1月1日～2019年10月30日在珠海市人民醫院產前檢查妊娠早期女性為研究對象。研究對象年齡19～45歲，平均年齡30.08±4.59歲，均同意進行口腔黏膜細胞采樣并進行葉酸代謝基因遺傳檢測，根據研究對象籍貫，將其分為南部地區500例(廣東省、廣西壯族自治區、湖南省)、中部地區465例(安徽省、湖北省、江西省、河南省)、北部地區450例(河北省、山東省、黑龍江省、遼寧省)3組。共獲取符合以上條件的有效樣本及結果1415例，其中漢族1402例，少數民族13例。

2.樣本采集及DNA檢測方法：(1)樣本采集：使用專用采樣拭子采集口腔黏膜上皮脫落細胞。該方法無創、無交叉感染、操作簡單方便。(2)檢測設備：采用美國Applied Biosystems公司的7900型熒光定量PCR儀，檢出率可達99%以上，可重復性達到100%。(3)基因分型技術：采用熒光定量PCR技術，對MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G進行基因分型。每個樣品檢測孔中加3.5μl去離子水，1μl濃度為20ng/μl的DNA模板，0.5μl的20×Taqman-MGB和5μl的2×Taqman Universal Master Mix探針，探針信息詳見表1。PCR反應初始溫度為95℃ 10min，92℃ 15s、60℃ 1min擴增20個循環，最后用89℃ 15s、60℃ 90s擴增30個循環。結束后，根據各反應孔的熒光，確定各樣本基因分型結果。

表1 Taqman-MGB 探針位置

3.統計學方法：采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行統計分析，對研究對象進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。組間比較采用行×列表的χ2檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.不同地區育齡女性MTHFR、MTRR的基因多態性比較:統計樣本人群中葉酸代謝障礙相關3個位點(MTHFR A1298C、MTHFR C677T、MTRR A66G) 的基因型數據并進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，發現這3個位點均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，證明研究對象具有該區域群體代表性。MTHFR A1298C 3個基因位點AA(野生型)、AC(雜合突變型)、CC(純合突變型)在南部、中部、北部3地區基因型分布多態性存在不一致，差異有統計學意義(P<0.05)，其中AA型在南部地區、中部地區和北部地區的比例為58.00%、63.87%和76.89%，呈南低北高趨勢。MTHFR C677T 3個基因位點CC(野生型)、CT(雜合突變型)、TT(純合突變型)在南部地區、中部地區和北部地區多態性分布不一致，差異有統計學意義(P<0.01)。CC型在南部地區、中部地區和北部地區的比例分別為57.80%、35.27%和14.67%，呈南高北低趨勢。MTRR A66G AG(雜合突變型)、CG(純合突變型)在3地區構成比較差異無統計學意義(P>0.05，表2)。

表2 3地區育齡女性MTHFR、MTRR的基因位點多態性比較 [n(%)]

2.不同地區育齡女性MTHFR、MTRR的等位基因頻率比較：MTHFR A1298C等位基因A和C頻率變異比較3地區存在明顯差異，差異有統計學意義(P<0.01)，其中突變C基因頻率南部地區比北部地區高11.23%；MTHFR C677T基因位點C和T在3地區頻率比較差異有統計學意義(P<0.01)，其中MTHFR667基因T基因頻率南部地區(24.20%)明顯低于北部地區(60.67%)；MTRR A66G基因位點中，A、C、G基因頻率南部與其他兩地區比較差異有統計學意義(P<0.05)，但中部地區及北部地區3個等位基因分布比較差異無統計學意義(P>0.05)，其中C基因頻率南部地區明顯高于其他兩地區，G基因頻率南部地區明顯低于其他兩地區，詳見表3。

表3 3地區育齡女性MTHFR、MTRR的等位基因頻率比較[n(%)]

3.不同地區育齡女性葉酸代謝障礙風險分析：根據本研究結果，南部地區、中部地區和北部地區葉酸代謝高風險的人群比例分別為11.80%、25.16%和38.23%，差異有統計學意義(P<0.01)；南部地區、中部地區和北部地區中風險的比例分別為37.80%、31.40%和25.33%，差異有統計學意義(P<0.01)；南部地區、中部地區和北部地區葉酸代謝低風險的人群比例分別為6.40%、10.54%和9.33%，差異無統計學意義(P>0.05)；南部地區、中部地區和北部地區葉酸代謝無風險的人群比例分為44.00%、32.90%和27.11%，差異有統計學意義(P<0.01)，詳見表4。

表4 3地區育齡女性葉酸代謝障礙風險分度結果[n(%)]

討 論

妊娠期女性體內的葉酸水平低于非妊娠期女性，并隨孕周增加而逐漸下降，故孕期是急需補充葉酸的特殊時期[2]。妊娠期的葉酸缺乏可導致妊娠期并發癥的發生、胎兒畸形甚至影響子代健康等不良后果[3]。既往研究表明,MTHFR、MTRR均是葉酸代謝過程中的關鍵酶，MTHFR在 5,10-亞甲基四氫葉酸還原成為5-甲基四氫葉酸的過程中起催化作用，后者在MTRR催化下參與人體內廣泛的甲基化反應，如同型半胱氨酸甲基化為甲硫氨酸，復甲基化為S-腺苷甲硫氨酸等。MTHFR、MTRR基因不同位點的突變會降低其酶的活性，不同程度的降低孕婦葉酸代謝水平[4]。所以了解不同地區妊娠期女性葉酸代謝基因位點及其變異特征，對基層醫院指導孕婦補充葉酸顯得非常重要。

C677T是MTHFR基因最常見的位點變異。MTHFR第667位核苷酸上胞嘧啶(C)變為胸腺嘧啶(T)，使編碼的氨基酸序列改變，纈氨酸替代丙氨酸，導致MTHFR酶的耐熱性和活性下降，使5,10-亞甲基四氫葉酸還原成為5-甲基四氫葉酸減少，從而降低體內葉酸水平[5]。研究顯示，母親MTHFR C677T純合子突變使出生神經管缺陷嬰兒的風險升高,攜帶677T等位基因的孕婦比野生型孕婦生育唐氏綜合征患兒的風險大, 胎兒患先天性心臟病的概率較CC型高[6～10]。通過對MTHFR、MTRR的3個基因多態性比較，南部地區、中部地區及北部地區存在地域差異，北部地區和中部地區MTHFR C667T的基因TT型率分別為36.00%和21.07%，明顯高于南部地區(5.80%)，同時葉酸代謝障礙高風險人群北部地區比南部地區高26.43%，提示此基因位點突變可能是導致葉酸代謝障礙的危險因素，此結果與賀憲民等[11]的研究結論一致。

A1298C位點突變是MTHFR基因另一個主要的位點變異。其突變導致編碼的氨基酸序列中谷氨酸被丙氨酸替代，導致MTHFR酶的活性下降，但耐熱性不變[5]。本研究結果顯示，A1298C基因AC型、CC型在3地區存在差異性，南部地區AC型、CC型高于中部地區和北部地區，但北部地區孕婦葉酸代謝障礙的發生率卻明顯高于南部地區。既往也有研究指出，A1298C基因AC型、CC型廣東及海南地區高于河北地區，且部分研究發現母親的MTHFR A1298C基因位點突變與不良妊娠結局、新生兒神經管畸形、新生兒先天性心臟病的發生無明顯相關性，提示單一的MTHFR A1298C基因突變是否會導致人群葉酸代謝障礙需進一步研究[12～15]。A66G是MTRR基因最常見的變異位點，在本研究中，MTRR A66G基因的突變型AC型、CG型在3地區比較差異無統計學意義。

個體對于葉酸的利用能力，是由葉酸代謝酶的基因多態性決定的。在服用同劑量及同療程葉酸的情況下，葉酸代謝障礙人群血清和紅細胞中的葉酸水平低于正常人群[16]。本研究結果顯示，葉酸代謝高風險人群在北部地區的比例為38.23%，比南部地區高26.43%，比中部地區高13.07%；未發現風險組北部地區低于南部地區16.89%。孔亞敏等[17]通過分析2004～2011年中國神經管缺陷(NTDs)報告得出我國NTDs發生率呈現北高南低的規律，與本研究結果一致。

綜上所述，葉酸基因代謝風險存在地域差異，尤其是北部地區，近一半的妊娠期女性存在葉酸代謝高風險，此結果對于尚未開展葉酸代謝檢測的基層地區的圍孕期女性孕期是否需要繼續或者加量服用葉酸提供指導。若本研究擴大樣本量，進行南部地區、中部地區和北部地區多中心研究，則研究結果更有說服力。