稀有血型孕婦IgG抗體亞型與新生兒溶血病的相關性分析

馬印圖 陳 莉 張 怡 董書文 楊曉亞 李莉華

母嬰Rh血型不合新生兒溶血病(Rh related hemolytic disease of the newborn，Rh-HDN)是由于孕婦和胎兒Rh血型不同而引起的胎兒或新生兒同種免疫性溶血性疾病。母親為Rh陰性，胎兒為Rh陽性，胎兒紅細胞經胎盤出血進入母體內刺激孕母產生血型特異性IgG抗D抗體，在40多個血型系統(tǒng)中，能夠引起HDN的主要有ABO、Rh、MNS、Kell、Kidd、Duffy等血型系統(tǒng)[1,2]。臨床以ABO-HDN為主，占85.3%，Rh-HDN約占14.6%，但Rh-HDN的發(fā)生率及嚴重程度遠高于ABO-HDN[3]。HDN的發(fā)生與孕婦和胎兒等多種因素有關，其中孕婦血清中IgG各亞型的含量與HDN密切相關[4]。本研究采用微柱凝膠技術回顧性分析了39例在河北省血液中心檢測以及在筆者醫(yī)院分娩的Rh(D)陰性孕婦，探討Rh血型抗體IgG亞型與產后新生兒高膽紅素血癥的相關性，為稀有血型孕婦精確檢測和精準治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)將結果報告如下。

資料與方法

1.病例資料：血液標本來源于2018年1月～2019年12月期間在河北省血液中心檢測及在筆者醫(yī)院分娩的39例稀有血型孕婦，年齡23～44歲，平均年齡28.5歲，孕周36±4周，無輸血史、過敏史、自身免疫性疾病和其他血液系統(tǒng)疾病、非近親婚配，分別檢測夫婦雙方的血型、孕婦不規(guī)則抗體、IgG抗體效價及其亞型含量、產后新生兒溶血相關試驗(直接抗球蛋白試驗、游離抗體試驗、抗體釋放試驗)、血常規(guī)和血液生化指標，對免疫性抗體IgG各亞型與患兒溶血情況進行回歸分析，評價孕婦血清IgG抗D抗體及其亞型與新生兒高膽紅素血癥嚴重程度的相關性。

2.試劑與儀器：血型檢測試劑、2-巰基乙醇(2-Me)、試劑紅細胞(長春博訊生物技術有限責任公司),電熱恒溫水浴箱(蘇州醫(yī)用儀器有限公司)，BASO低速離心機(中國臺灣貝索企業(yè)有限公司)，抗體篩查卡(瑞士DiaMed公司), ABO/Rh血型卡及IgG亞型檢測卡、孵育器、離心機(江蘇力博醫(yī)藥生物技術股份有限公司)，全自動血液細胞分析儀(日本Sysmex公司)，全自動生化分析儀(德國Roche公司)。ABO/Rh血型鑒定、抗體篩查和新生兒溶血試驗均嚴格按照相關文獻進行操作[5,6]。

3.IgG抗D抗體效價及亞型含量測定：抗體篩查試驗嚴格按說明書進行操作，IgG亞型檢測首先將孕婦血清進行倍比稀釋2、4、8、16……，取IgG亞型檢測卡，做好標記，在低離子IgG亞型檢測卡中分別加入倍比稀釋的孕婦血清25μl和0.6%～0.8% O型Rh(D)陽性紅細胞50μl，將凝膠卡置37℃孵育器內溫浴15min，專用離心機離心5min,取出檢測卡判讀結果，以出現(xiàn)凝集的強弱判定受檢者血清中IgG抗體亞型含量[7]。

4.統(tǒng)計學方法:采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較采用Kendall和Mann-whitnryU檢驗，二分類反應變量采用Logistic回歸分析,評價孕婦血清抗D抗體IgG亞型含量與新生兒高膽紅素血癥嚴重程度的相關性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.孕婦抗體效價與產后新生兒HDN相關性：在39例稀有血型孕婦中，夫婦雙方ABO血型相合21例，不相合的18例，有27例孕婦血清抗D抗體效價≥64，5例抗D抗體效價為2～32，7例未產生抗D抗體。27例抗D抗體高效價孕婦分娩的嬰兒有20例確診為Rh-HDN，4例可疑為Rh-HDN,3例不能確認，發(fā)生率74.01%，5例抗D抗體低效價孕婦分娩的嬰兒有2例確診為Rh-HDN，發(fā)生率40.00%，Rh系統(tǒng)總體發(fā)生HDN的比例為56.41%。抗D抗體效價≤32組、64～256組及效價≥512組3組新生兒HDN發(fā)生率分別為16.67%(2/12)、69.57%(16/23)、100.00%(4/4)，進行Kendall相關分析，結果顯示差異有統(tǒng)計學意義(r=0.213，P=0.000)。

2.孕婦IgG亞型與產后新生兒HDN相關性：在39例稀有血型孕婦中有22例IgG1和IgG3亞型升高，產后新生兒均出現(xiàn)了不同程度的溶血癥狀，而10例僅有IgG2和IgG4亞型升高的孕婦其新生兒溶血癥狀輕微或未出現(xiàn)高膽紅素血癥，7例沒有IgG抗D抗體的孕婦產后新生兒未出現(xiàn)溶血癥狀。Rh-HDN組母親血清中IgG亞型抗體含量明顯高于非HDN組，兩組間IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 4類亞型檢測結果進行比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，兩組IgG亞型含量比較差異有統(tǒng)計學意義，HDN組各亞型均高于非HDN組，詳見表1。

表1 HDN組與非HDN組IgG亞型檢測結果比較(n)

3.IgG亞型含量與HDN的相關危險因素分析：39例孕婦中有22例產后新生兒發(fā)生了HDN，以HDN發(fā)病為應變量(Y)，IgG 4個亞型反應凝集強度、丈夫血型為自變量(X)進行二分類反應變量Logistic回歸分析。IgG1是HDN發(fā)病的獨立危險因素，IgG1每增加1個水平，HDN的發(fā)病風險提高3.712倍，詳見表2。

表2 HDN發(fā)生因素的Logistic回歸分析結果

4.HDN溶血程度與IgG亞型的關系：對22例Rh-HDN患兒進行分組，新生兒總膽紅素≥200μmol/L判定為中重度黃疸，經患兒血液生化指標檢測，輕度黃疸(M)15例，中重度黃疸(M+S)7例。檢測兩組患兒IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亞型含量，組間比較采用Mann-WhitnryU檢驗，IgG1和IgG2組間比較差異有統(tǒng)計學意義，IgG3和IgG4亞型組間比較差異無統(tǒng)計學意義，結合患兒的臨床表現(xiàn)，其中重度HDN的患兒均伴有IgG1和IgG3含量的升高，結果見表3。

表3 輕度組與中重度組IgG亞型比較(n)

5.IgG亞型含量與溶血3項試驗的相關性：檢測IgG亞型與新生兒溶血3項試驗，二者存在明顯的一致性，3項試驗均陽性者臨床溶血癥狀明顯加重，進一步分析發(fā)現(xiàn)，經溶血試驗證實與血型相關的Rh-HDN患兒及其母親血清中IgG1、IgG3的含量均明顯升高, 且以IgG1為主,而重度HDN患兒體內的IgG3含量亦同步升高，患兒與其母親體內亞型含量呈正相關，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 27例抗D抗體效價≥64的孕婦，產后新生兒有10例因重度HDN進行了換血治療，換血率為37.04%，提示Rh系統(tǒng)高效價孕婦產后新生兒HDN的嚴重程度更高， IgG亞型與新生兒溶血試驗結果比較詳見表4。

表4 IgG亞型與新生兒溶血試驗結果比較(n)

討 論

Rh-HDN病因是由于Rh血型抗體進入胎兒體內破壞胎兒紅細胞引起的，正常情況下胎兒體內的IgG主要依賴于母體轉移而來。IgG是血清中含量最高、唯一能夠通過胎盤屏障的免疫球蛋白[8]。新生兒發(fā)生Rh-HDN的輕重與胎兒D抗原的免疫原性、孕婦的免疫狀態(tài)、血型抗體效價等多種因素有關，胎兒受累程度與IgG亞型含量密切相關[9～11]。IgG各亞型在血清中的含量依次為IgG1>IgG2>IgG3>IgG4；激活補體的能力IgG3>IgG1>IgG2>IgG4，各亞型通過胎盤的能力文獻報道的結果略有差異[12,13]。4種亞型在靶向親和力、與抗原結合能力、免疫復合物的形成、激活補體、觸發(fā)效應細胞以及胎盤轉運特性等方面各自具有不同的生物學特性[14,15]。IgG1是IgG中最重要的亞型，其Fc段與巨噬細胞FcrR1、FcrRHA/B,C、FcrRⅢA/B結合能力很強，并且具有很強的激活補體能力。IgG2含量次之,其主要針對多糖類抗原產生免疫反應，在對多糖抗原的免疫應答中占優(yōu)勢。IgG3雖然僅占IgG總量的4%～8%，但其Fc段與巨噬細胞表面受體結合能力非常強，激活補體的能力是4類亞型中最強的免疫球蛋白，在免疫應答中常表現(xiàn)出比IgG1更高的親和力，故免疫活性比IgG1要高[16]。IgG4含量最少，對抗原的親和性低，不能結合C1q補體和激活經典補體途徑。與巨噬細胞FcrRⅢB的結合能力IgG3>IgG1,而IgG2和IgG4幾乎不引起紅細胞破壞作用[17]。

IgG亞類在臨床一些疾病中也具有一定的特性，研究者在血液系統(tǒng)的疾病中已經有了一些相應的研究[18]。Rh-HDN同樣也是溶血性疾病，病情進展與IgG亞型同樣存在關聯(lián)性[19]。本研究僅針對39例Rh陰性稀有血型孕婦進行了IgG亞型與HDN方面的回顧性分析，采用微柱凝膠技術，對其中的22例新生兒確診為Rh-HDN的孕婦血清進行檢測分析，HDN組母親血清中IgG抗體亞型含量明顯高于非HDN組。IgG1是HDN發(fā)病的獨立危險因素。確診為HDN的患兒及其母親血清中均伴有IgG1和IgG3含量的升高，以IgG1為主,IgG3含量與HDN的溶血程度呈正相關，因此，HDN的發(fā)生與IgG1和IgG3的含量密切相關，而與IgG2和IgG4的相關程度不高。

基于以上研究，對于血型抗體高效價的孕婦有必要檢測IgG各亞型含量，對于IgG1和IgG3亞型含量高的孕婦要積極干預治療，而僅是IgG2和IgG4含量升高則不必治療，定期檢測即可，從而實現(xiàn)精確診斷和精準治療。由于本研究樣本量較小，影響HDN的相關因素較多，包括胎兒紅細胞上血型抗原性強弱、胎盤的致密性及轉運抗體的能力、經胎盤出血量、胎兒營養(yǎng)狀況以及肝臟、脾臟的成熟度等，除了檢測夫妻雙方ABO/Rh血型、孕婦不規(guī)則抗體篩選、抗體效價測定、新生兒血常規(guī)、網織紅細胞計數(shù)、膽紅素測定、溶血3項試驗等這些公認的檢測指標，一些更精準的指標如單核細胞單層檢測、熒光激活細胞分選技術快速定量分析、胎兒血型基因檢測、HR131基因與HH131基因測定以及CD144+內皮細胞顆粒檢測等檢測技術手段有待于進一步研究[20，21]。