補腎壯筋湯含藥血清介導的Sox9基因高表達對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞損傷的保護機制研究

吳鋒鋒 高宏梁 王國榮 李建有 黃 勝 蔣雪生 李雄峰

骨關節炎(osteoarthritis, OA)是老年人最常見的關節炎，可引起關節慢性疼痛并可導致殘疾。口服非甾體抗炎藥可快速緩解早期的癥狀，但不能明顯延緩疾病的進程，且這類藥物長期服用有很多不良反應，特別是消化道的不良反應[1]。因此,尋找更加可靠的藥物替代方案一直是OA治療的目標[2]。

祖國醫學認為，OA屬于“骨痹”、“痹癥”等范疇。《素問·上古天真論》 曰：“丈夫……七八肝氣衰，筋不能動，天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極”。可見其多因肝腎虧虛、筋脈失養而發病。補腎壯筋湯(BZD)出自清代錢秀昌《傷科補要》，其中熟地黃、山茱萸填精益髓、滋補肝腎，續斷、杜仲補肝腎、強筋骨，五加皮、茯苓健脾利濕，青皮理氣，白芍、當歸補血活血，牛膝補肝腎、強筋骨。諸藥合用，起到補益肝腎，強筋壯骨的功效，是我國著名的OA治療成方。臨床試驗顯示，BZD可顯著改善OA患者的癥狀和體征[3,4]。

然而，BZD作用的分子機制仍不清楚，可能是非常復雜和多方面的。Lin等[5]研究發現，BZD可增強衣霉素 (TM)刺激的軟骨細胞活力，抑制由內質網應激介導的TM誘導的SD大鼠軟骨細胞凋亡。SRY-box 9(Sox9)基因在軟骨發育中起重要作用，是軟骨間充質細胞向軟骨細胞分化的關鍵轉錄因子。此外，它還參與調節軟骨細胞分化的各個階段[6]。先前的研究表明，Sox9的過表達可促進軟骨修復[7]。因此，本研究目的是確定BZD是否可通過提高Sox9的表達來保護OA細胞模型中的軟骨細胞，并闡明其潛在的機制。

材料與方法

1.材料：4周齡雄性SD大鼠16只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：2017-0008，飼養在浙江中醫藥大學動物實驗中心清潔級(SPF)動物房中，其中4只用于制備BZD含藥血清，12只用于分離軟骨細胞。其他主要材料：DMEM培養基、澳洲胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；膠原蛋白Ⅱ多克隆抗體(142kDa，Ab34712)、Sox9多克隆抗體 (70kDa，Ab185966)購自英國Abcam公司，稀釋度分別為1∶5000和1∶1000；蛋白聚糖Aggrecan單抗(250kDa，NB600-504)購自美國Novus公司，稀釋度為1∶100；RT-PCR試劑盒購自美國Promega公司。本研究經浙江中醫藥大學科研倫理學委員會批準，批準文號2017123。

2.方法：(1)BZD含藥血清的制備：BZD是中藥飲片，由浙江中醫藥大學實驗室提供，含10味中藥，包括熟地黃、山茱萸、續斷、杜仲、五加皮、白芍、當歸、茯苓、青皮、牛膝，其最終濃度為1g/ml(相當于原料的干重)。BZD(18.5g/kg，相當于成人1次的劑量)連續給藥7天(每天2次)。最后1次給藥2h后，處死大鼠(n=4)，從頸動脈取血。血樣在4℃下凝血2h， 上清液1500r/min離心20min，56℃失活30min，過濾后-80℃保存。(2)軟骨細胞分離和培養：從大鼠膝關節軟骨中分離、培養軟骨細胞(n=12)，并按先前已報道的方法進行鑒定[4]。將軟骨細胞先用0.1%胰蛋白酶預消化30min，再用1.5mg/ml的膠原酶Ⅱ消化16h，離心后收集細胞。分離的軟骨細胞在10%胎牛血清的培養基中進行培養和傳代，同時加入青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml，放在37℃含5%二氧化碳的孵育器中。(3)實驗分組：選取第2代(P2)軟骨細胞用于實驗，因為它們已經被證明是膠原蛋白Ⅱ含量豐富，能表現出典型的軟骨細胞形態[3,4]。軟骨細胞隨機分為3組,即對照組，P2軟骨細胞不予任何干預；模型組, IL-1β(10μg/ml)刺激P2軟骨細胞24h; BZD組，IL-1β(10μg/ml)刺激P2軟骨細胞24h，然后加入BZD含藥血清(400μg/ml)。BZD干預72h后收集所有軟骨細胞進行分析。(4)軟骨細胞活性測定：采用MTT比色法檢測BZD對軟骨細胞活性的影響。BZD給藥72h后，3組細胞中各加入0.5mg/ml MTT溶液，37℃孵育4h，棄上清液,將晶體溶解在100μl二甲基亞砜(DMSO)溶液中。使用酶標儀(美國Hercules公司)在570nm處讀取吸光度。(5)Sox9、蛋白聚糖aggrecan、膠原蛋白Ⅱ蛋白水平的測定：采用細胞裂解液(RIPA∶PMSF∶Cocktail =100∶1∶2)于冰上裂解細胞，BCA法檢測蛋白濃度。取150μg蛋白經10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移至PVDF膜上。采用5% BSA室溫封閉40min，蛋白一抗冰上過夜孵育，二抗室溫孵育60min，采用雙色紅外激光成像系統采集圖像。每組重復3 次。(6)Sox9、蛋白聚糖aggrecan(Acan)、膠原蛋白Ⅱ(Col2a1)基因水平的測定：采用Trizol法提取軟骨細胞總RNA，超微量核酸分析儀檢測總RNA的濃度與純度。采用美國Promega公司試劑盒進行熒光定量PCR檢測，按照試劑盒說明書操作。反應步驟: 95℃ 5min，95℃ 10s，58℃ 1min，共30個循環。以2-ΔΔCT表示相對表達量。Sox9引物序列：上游引物5′-GCGAGCAGCAGCAGCACTC-3′，下游引物5′-TCTGGTGGTCGGTGTAGTCATACTG-3′。Acan引物序列：上游引物5′-CCAGTCTACCCAGCACCCTA-3′，下游引物5′-TCAGGGACTTGGCTGTTTCT-3′。Col2a1引物序列：上游引物5′-GGCTCCCAGAACATCACCTA-3′，下游引物5′-GCCCTCATCTCCACATCATT-3′。內參基因Gapdh引物序列：上游引物5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

結 果

1. 分離培養的大鼠軟骨細胞的形態及其鑒定：倒置顯微鏡下觀察分離培養的原代軟骨細胞，結果顯示培養9～12h部分細胞貼壁，培養至24h絕大部分細胞貼壁，細胞開始伸展，細胞體積較小，呈多角形，均勻散在生長(圖1A)。3天左右細胞匯合成單層鋪滿整個培養瓶底部。4天左右首次傳代后增殖速度加快，隔天可再次傳代，呈明顯的“鋪路石”樣(圖1B)。傳至第6代，細胞呈長梭型，開始老化。第7代后細胞呈梭狀平鋪，折光差，部分細胞脫落，生長速度減慢，傳代周期延長，軟骨細胞表型退化。由于Ⅱ型膠原的合成與分泌是軟骨細胞維持其分化表型的特定指標。細胞鑒定結果顯示，培養的軟骨細胞胞質中Ⅱ型膠原的棕黃色顆粒較多，呈強陽性表達，可見典型的軟骨細胞形態(圖1C)。

2．IL-1β誘導的軟骨細胞損傷：對照組表現為基本正常的軟骨細胞形態(圖2A),模型組出現軟骨細胞的肥大和萎縮等軟骨細胞損傷的征象(圖2B),BZD組軟骨細胞形態學的損傷較模型組減輕(圖2C)。

3.軟骨細胞活性：與對照組比較，模型組中軟骨細胞活性顯著降低(P=0.000)，BZD組和模型組比較，軟骨細胞活性增強(P<0.05)，詳見圖3。

4.Sox9、蛋白聚糖aggrecan和膠原蛋白Ⅱ的基因和蛋白表達：與對照組比較，模型組Sox9、蛋白聚糖aggrecan和膠原蛋白Ⅱ的基因和蛋白表達水平均顯著降低 (P=0.000)。在BZD組, Sox9、蛋白聚糖和膠原蛋白Ⅱ的基因和蛋白表達水平較模型組均顯著升高(P<0.05,圖4、圖5)。

討 論

關節軟骨的破壞和丟失是OA的一個主要特征。軟骨細胞是軟骨中唯一的細胞，嵌入在廣泛的細胞外基質(ECM)中，ECM主要由膠原和蛋白多糖組成，關節軟骨中的膠原主要為Ⅱ型，關節軟骨的主要蛋白多糖為aggrecan[8]。Sox9是一種轉錄因子，它對許多軟骨細胞ECM基因的表達至關重要，并在軟骨細胞分化過程中發揮作用[7]。BZD在中國長期被用于OA患者的治療，臨床研究表明，BZD可改善OA患者的癥狀[3,4]。然而，BZD在OA中的分子機制尚不明確，研究發現BZD通過刺激SD大鼠的細胞周期進程促進軟骨細胞增殖[9]。也有研究表明，補腎壯筋湯可清除氧自由基，促進軟骨細胞增殖，抑制軟骨細胞凋亡，抑制滑膜炎癥，提高軟骨細胞抗異常應力水平[10]。

本研究結果顯示，BZD提高了IL-1β誘導的軟骨細胞Sox9、蛋白聚糖aggrecan和膠原蛋白Ⅱ的表達, 從而促進軟骨細胞的活性。Sox9是一種重要的轉錄因子，參與多種器官和組織的發育，尤其是軟骨形成。值得注意的是，Sox9可轉錄激活許多軟骨特異性結構成分和調節因子的基因[11]。在正常軟骨細胞中，Sox9調控蛋白聚糖aggrecan和膠原蛋白Ⅱ的表達[11]。正常的關節軟骨依賴于合成和分解細胞因子之間的平衡。IL-1β是促炎性細胞因子和分解代謝的關鍵因子，導致金屬基質蛋白酶的產生、減少膠原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖aggrecan的表達[12]。在最近的研究中，IL-1β被用來建立SD大鼠軟骨細胞的細胞OA模型。本研究在IL-1β的影響下，軟骨細胞出現Sox9、膠原蛋白Ⅱ和aggrecan的快速減少。重要的是， BZD可緩解IL-1β的作用，進一步支持BZD在 Sox9的信號通路的作用。

綜上所述，本研究結果支持使用BZD作為一種有效的藥物治療OA。它可能通過參與關節軟骨結構和功能的Sox9及其靶基因的正向調控，刺激細胞增殖。但是，BZD對動物模型和OA患者Sox9信號通路的調控還有待于進一步研究。