lncRNA SCGB1B2P通過調控SPRY2基因表達對腎癌細胞增殖和侵襲的影響

魯帥奇 李小輝 郝彤彤 韓興濤 張 寒

腎癌是全世界泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康，因其易轉移、預后差，對其發生、發展的機制研究具有重要臨床意義[1]。腎癌的發生包括抑癌基因失活、原癌基因激活等多種分子變化[2]。越來越多的研究顯示，非編碼RNA特別是長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在腎癌中具有重要調控作用[3]。lncRNA指轉錄本長度>200個核苷酸的非編碼RNA，不能編碼蛋白質，最初被認為是基因組轉錄的“噪聲”[4]。近年來研究顯示，lncRNA廣泛參與基因組印跡、染色質修飾、X染色體沉默等多種細胞調控，與腎癌的發生、發展密切相關[5]。SCGB1B2P是一個尚未被報道研究的lncRNA，其在腎癌中的表達和作用機制亦不明確。本研究通過檢測SCGB1B2P在腎癌組織和腎癌細胞株中的表達，分析SCGB1B2P與腎癌的發生、發展的相關性，通過體外細胞轉染上調腎癌細胞中SCGB1B2P的表達，觀察其對腎癌細胞增殖和侵襲的影響，并探討其作用機制。

材料與方法

1.材料：(1)細胞和主要試劑：腎癌細胞株(Caki-1、ACHN、786-O、OS-RC-2、A498)和正常腎小管上皮細胞(HK-2)購自中國典型培養物保藏中心。表達SCGB1B2P的質粒和表達無意義序列的質粒購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。RPMI1640培養基、DMEM/F12培養基和胎牛血清購自美國Hyclone公司。轉染試劑LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司。Transwell小室購自美國康寧公司。熒光實時定量PCR(qPCR)試劑盒購自天根生化科技有限公司；ECL顯影液購自美國Thermo公司。噻唑藍(methyl thiazol tetrazolium，MTT)試劑盒和二甲基亞砜購自南京凱基生物科技發展有限公司。Matrigel基質膠購自美國BD公司。一抗購自美國Cell Signaling Technology公司。二抗購自武漢博士德生物有限公司。(2)臨床標本：選取2017年3月～2018年11月于鄭州大學附屬洛陽中心醫院泌尿外科就診并接受手術治療的腎癌患者82例，患者平均年齡為45.8±11.87歲，收集術中腎癌組織標本及癌旁組織，所有標本均經病理學確診。患者術前均未接受過放療、化療。本研究經筆者醫院醫學倫理學委員會審核并通過，患者均簽署知情同意書。

2.細胞培養與轉染：腎癌細胞株(Caki-1、ACHN、786-O、OS-RC-2、A498)用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液培養，正常腎小管上皮細胞(HK-2)用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基培養，于37℃、5% CO2的培養箱中培養。將OS-RC-2接種于6孔板中，隨機分為實驗組和對照組，根據LipofectamineTM3000 操作說明書操作，分別轉染表達SCGB1B2P的質粒或表達無意義序列的質粒，保證lncRNA的終濃度為10nmol/L，轉染12h后更換新鮮培養基。

3.qPCR檢測：采用TRIzol法提取腎癌組織和細胞株總 RNA，采用反轉錄試劑盒反轉錄得到cDNA。以GAPDH為內參，采用qPCR試劑盒檢測SCGB1B2P及SPRY2 mRNA 的表達水平， qPCR反應條件為：95℃ 3min，95℃ 20s，56℃ 15s，68℃ 15s，40個循環。GAPDH正向引物：5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，反向引物：5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′；SPRY2正向引物：5′-CTCGGCCCAGAACGTGATT-3′，反向引物：5′-GGCAAA-AAGAGGGACATGACAC-3′；SCGB1B2P正向引物：5′-GTCGTGCAGCAACTGGAA-3′，反向引物：5′-CAGATTCTCATGGTTGGGACA-3′。熒光信號值采用2-ΔΔCt方法分析。

4.MTT法檢測：將兩組OS-RC-2細胞以4×103個/200μl的細胞密度接種于96孔板，培養1、2、3、4、5天后進行MTT法檢測。檢測時，每孔加入15μl MTT試劑，在37℃、5% CO2的培養箱孵育3h，每孔加入120μl二甲基亞砜，充分振蕩，采用酶標儀檢測每孔在450nm波長處的吸光度(A)值。

5.Matrigel實驗：將Matrigel基質膠和無血清培養基按照1∶6比例稀釋，每個上室加入60μl稀釋液，在37℃、5% CO2的培養箱靜置1h使膠凝固。將兩組OS-RC-2細胞以4×104個/200微升的細胞密度接種于上室，下室加入600μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，培養36h后，取出上室，采用多聚甲醛固定40min，采用結晶紫染液染色20min，PBS溶液沖洗后，棉簽輕輕擦去上層未侵襲的細胞。100倍顯微鏡下，隨機選6個視野拍照并計數、統計。

6.Western blot法檢測：將兩組OS-RC-2細胞采用PBS溶液洗3遍后，加入高效細胞裂解液裂解細胞，提取細胞全蛋白。采用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，每孔蛋白上樣量為30μg，電轉法轉移至NC膜。在5%脫脂牛奶中室溫封閉120min，在一抗中4℃下孵育過夜，在二抗中室溫下孵育 60min，采用ECL顯影液曝光顯影。

結 果

1.腎癌組織和癌旁組織中SCGB1B2P的表達水平：腎癌組織和癌旁組織中SCGB1B2P的表達水平分別為1.06±0.20和3.93±0.60，腎癌組織中SCGB1B2P表達水平均低于癌旁組織(P<0.01),詳見圖1。

2.腎癌細胞和正常腎小管上皮細胞中SCGB1B2P的表達水平：腎癌細胞株(Caki-1、ACHN、786-O、OS-RC-2、A498)和正常腎小管上皮細胞(HK-2)中SCGB1B2P的表達水平分別為0.61±0.05、0.76±0.04、0.44±0.05、0.11±0.02、0.59±0.07和1.01±0.08，腎癌細胞系中SCGB1B2P表達水平均低于正常腎小管上皮細胞(P<0.05，圖2)。OS-RC-2細胞中SCGB1B2P的表達水平最少(P<0.01)，故選擇OS-RC-2細胞進行后續實驗。

3.兩組OS-RC-2細胞中SCGB1B2P的表達水平：轉染48h后，收集兩組OS-RC-2細胞，提取總RNA并進行qPCR檢測SCGB1B2P的表達水平。實驗組和對照組OS-RC-2細胞中SCGB1B2P表達水平分別為11.22±1.13和1.12±0.29，實驗組明顯高于對照組(P<0.01)。

4.上調SCGB1B2P抑制OS-RC-2細胞的增殖能力：MTT法檢測兩組OS-RC-2細胞的增殖能力，從第3天起，實驗組細胞與對照組比較，增殖能力明顯受到抑制(P<0.05，圖3)。

5.上調SCGB1B2P抑制OS-RC-2細胞的侵襲能力：Matrigel實驗檢測兩組OS-RC-2細胞的侵襲能力。實驗組和對照組OS-RC-2細胞侵襲細胞數分別為30.85±5.79和87.26±10.02，與對照組比較，上調SCGB1B2P后明顯抑制OS-RC-2細胞的侵襲能力，差異有統計學意義(P<0.01，圖4)。

6.上調SCGB1B2P促進腎癌OS-RC-2細胞中SPRY2 mRNA的表達：qPCR檢測兩組OS-RC-2細胞SPRY2 mRNA的表達情況，實驗組和對照組OS-RC-2細胞SPRY2 mRNA的表達分別為5.41±0.58和1.25±0.52， 上調SCGB1B2P能使SPRY2 mRNA表達水平升高(P<0.01)。

7. 上調SCGB1B2P促進腎癌OS-RC-2細胞中 SPRY2 蛋白表達：Western blot法檢測結果顯示，上調SCGB1B2P引起SPRY2蛋白表達升高，SPRY2蛋白表達升高后，造成Wnt/β-catenin信號通路蛋白如PP2A、GSK3及CK1α蛋白表達降低(圖5)。

討 論

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的產物，通過轉錄抑制、轉錄激活等調控基因的表達，與細胞的分化、增殖、凋亡、衰老等各種活動密切相關[6]。lncRNA在腫瘤中的作用機制是近年來的研究熱點，在結直腸癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤中均存在lncRNA的表達異常[7～9]。目前已發現的與腎癌有關的lncRNA包括ENST00000434223、ROR、KCNQ1DN、ITGB1等，在腎癌組織中表達上升或降低，參與調控腎癌細胞的增殖、遷移、侵襲等能力，與腎癌患者的預后及復發相關[3,10～12]。lncRNA在腎癌中發揮重要作用，具有潛在的臨床應用價值。SCGB1B2P長度為612個核苷酸，是一種在腫瘤包括腎癌中尚未被報道研究的lncRNA。本研究通過檢測SCGB1B2P在腎癌組織和細胞中的表達水平，發現SCGB1B2P在腎癌組織和細胞中表達下調，提示SCGB1B2P可能參與腎癌的發生、發展。

MTT實驗和Matrigel實驗結果顯示，上調SCGB1B2P可明顯降低腎癌細胞的增殖能力和侵襲能力，SCGB1B2P在腎癌中可能發揮抑癌基因的功能。SPRY2(sprouty RTK signaling antagonist 2)蛋白是Sprouty家族蛋白之一，含315個氨基酸殘基[13]。越來越多的研究表明，SPRY2在前列腺癌、胃癌、卵巢癌等惡性腫瘤細胞中的表達被明顯抑制，與腫瘤細胞異常的增殖和侵襲能力密切相關，SPRY2的低表達參與腫瘤的發生、發展[13～15]。SPRY2在腎癌組織中表達明顯降低，SPRY2的表達水平與腎癌的不良預后呈負相關[16]。上調SPRY2的表達可抑制腎癌細胞的增殖、侵襲等惡性生物學行為，SPRY2蛋白已成為腎癌防治研究重點[16]。本研究通過上調腎癌細胞中SCGB1B2P的表達，SPRY2基因的表達水平明顯增加，表明SCGB1B2P可明顯促進SPRY2基因的表達。有研究表明，SPRY2通過抑制Wnt/β-catenin信號通路轉導，負向調控細胞的生長和轉移能力[17]。本研究結果表明，SPRY2基因表達降低后，Wnt/β-catenin信號轉導通路蛋白如PP2A、GSK3及CK1α表達降低。SCGB1B2P調控SPRY2基因表達的具體作用機制尚不明確，這是本研究的不足之處。

綜上所述，本研究證明了SCGB1B2P在腎癌中表達下調，高表達SCGB1B2P可抑制腎癌細胞的增殖和侵襲能力，其作用機制可能是SCGB1B2P促進SPRY2基因的表達。本研究對揭示腎癌發病機制具有重要意義，SCGB1B2P可能為腎癌的診治提供了新的診斷標志物和治療靶標。