苯丁酸鈉通過下調(diào)CLDN4基因DNA甲基化對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌增殖與凋亡的作用研究

卡衣賽爾·卡哈爾 艾力根·阿不都熱依木 譚元元

喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是一種侵襲性惡性腫瘤，為喉癌最常見的病理類型，吸煙、飲酒、空氣污染和不健康飲食等均是LSCC 發(fā)生的決定因素[1～3]。目前，LSCC的治療方式主要包括放療、手術(shù)并輔以化療，這些手段能夠使大部分患者的病情得到有效控制，但仍有一些患者病情難以控制，例如術(shù)后存在組織與器官損傷、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移以及局部及全身并發(fā)癥等問題[4，5]。目前，LSCC 的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，因此，了解LSCC進(jìn)展中的分子調(diào)節(jié)機(jī)制將有助于提高LSCC的診斷和治療水平。苯丁酸鈉(sodium phenylbutyrate，SPB)是一種誘導(dǎo)分化劑，對(duì)多種腫瘤具有誘導(dǎo)分化、凋亡和殺傷作用，可通過抑制組蛋白脫乙酰基酶來抑制腫瘤細(xì)胞的生長，調(diào)控多種特定基因的轉(zhuǎn)錄水平[6,7]。DNA甲基化可以使DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及 DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的方式均發(fā)生改變[8]。越來越多的證據(jù)表明，DNA甲基化參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，比如在腫瘤中通過調(diào)節(jié)DNA 損傷、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞黏附等相關(guān)基因來發(fā)揮作用[9～11]。但苯丁酸鈉對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞的生物學(xué)行為是否有影響，且能否通過 DNA去甲基化發(fā)揮作用，目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究通過探究苯丁酸鈉對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，并從表觀遺傳學(xué)角度探索相關(guān)分子機(jī)制，為臨床LSCC的診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.材料：喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞 Hep-2 (中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，苯丁酸鈉 (德國 Alexis公司)，胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國Invitrogen公司)，MTT溶液、DMSO(美國 Sigma公司)，Annexin Ⅴ/PI試劑盒(德國 Bendermed公司)，免疫熒光染色試劑盒、RIPA裂解液、Bradford蛋白測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，ECL發(fā)光試劑盒(美國 Gibco公司)，Taq 酶、RNAiso Plus試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，DNA提取試劑盒、DNA甲基化試劑盒(美國Thermo Fisher 公司)，兔抗CLDN4、鼠抗β-actin、兔抗caspase-3(北京中杉金橋公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(英國 Abcam公司)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞 Hep-2復(fù)蘇后，植入含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素雙抗RPMI1640 培養(yǎng)基中，放在 37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天換液1次，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.細(xì)胞處理與增殖檢測：對(duì)數(shù)生長期Hep-2細(xì)胞經(jīng) 0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104/ml并接種于96孔板，每孔100μl，在 37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄原培養(yǎng)液，加入終濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L的苯丁酸鈉，以0mmol/L(不加苯丁酸鈉)作為對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。24h后每孔滴加20μl MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，每孔滴加150μl DMSO，于脫色搖床上振蕩10min，使紫藍(lán)色沉淀充分溶解，采用酶標(biāo)儀測定波長570nm處測吸光度(A)值。

4.細(xì)胞周期檢測：經(jīng)不同濃度的苯丁酸鈉處理Hep-2細(xì)胞24h 后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，并預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入70%冰乙醇進(jìn)行固定，固定24h后，棄乙醇，用PBS洗滌2次并重懸細(xì)胞，加入含10μg/ml RNase的鹽酸緩沖液在37℃下孵育 30min，再加入500μl PI 進(jìn)行染色，37℃避光孵育30min，進(jìn)行過300目篩網(wǎng)，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

5.細(xì)胞凋亡檢測：經(jīng)不同濃度的苯丁酸鈉處理Hep-2細(xì)胞24h后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌2次，用500μl 1×Binding Buffer重懸各組細(xì)胞，加入5μl Annexin Ⅴ-FITC染液與10μl PI染液，室溫下避光孵育30min后，立即采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。

6.細(xì)胞免疫熒光法檢測caspase-3的表達(dá)：調(diào)整Hep-2細(xì)胞密度為 2×105/ml，將滅菌蓋玻片吸附于6孔板中，接著將細(xì)胞接種于6孔板，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入終濃度為4.0mmol/L的苯丁酸鈉，0mmol/L苯丁酸鈉設(shè)為對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24h后棄培養(yǎng)液，使用PBS將蓋玻片洗滌3次，4%多聚甲醛固定15min，加入0.2%Triton X-100滲透5min，與3%BSA、0.2%吐溫共孵育60min，然后加入兔抗caspase-3(1∶100)，4℃孵育過夜，次日PBS 沖洗3次，然后加入Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶750)室溫孵育30min。使用DAPI 染細(xì)胞核10min，爬片晾干后，封片并在顯微鏡下觀察，進(jìn)行圖像采集。

7.qRT-PCR檢測DNMT1、DNMT3a mRNA的表達(dá)：用 RNAiso Plus試劑提取經(jīng)不同濃度的苯丁酸鈉處理24h的Hep-2細(xì)胞總 RNA，紫外分光光度計(jì)檢測所提取RNA的純度與濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù) SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書檢測DNMT1、DNMT3a mRNA水平，以GAPDH 為內(nèi)參，引物由上海生工生物有限公司合成，DNMT1上游引物：5′-ACCATCACATCTCATTTTGC-3′，下游引物：5′-GGTTTGACTTCGGAGTCTCT-3′;DNMT3a上游引物：5′-TGATGAGCGCACAGAGAGC-3′，下游引物：5′-GTGTTCCAGGTACATTGAG-3′;GAPDH上游引物：5′-TGGGCATCAATGGATTTGGCT-3′，下游引物：5′-ACCATGTATTCGGGTCAT-3′。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，95℃變性20s，62℃退火15s，72℃延伸45s，一共循環(huán)40次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

8.Western blot法檢測CLDN4 蛋白的表達(dá)：收集經(jīng)不同濃度的苯丁酸鈉處理24h的Hep-2細(xì)胞，在各組細(xì)胞中加入RIPA裂解液，提取總蛋白，Bradford法對(duì)提取蛋白進(jìn)行定量。取20μg蛋白上樣進(jìn)行10% 的SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，TBST洗膜3次，加入兔抗CLDN4 (1∶1000)與鼠抗β-actin (1∶1000)為第一抗體，置于4℃下孵育過夜，次日TBST洗膜3次，并加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗 (1∶5000)常溫孵育2h，TBST再次洗膜，滴加ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)其曝光拍照，再用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

9.甲基化特異性 PCR：(1)按照DNA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，提取不同濃度苯丁酸鈉處理的Hep-2細(xì)胞的DNA。將300ng待測樣品 DNA用 DDW稀釋至終體積45μl，加入5μl Methyl SEQrTMDenaturation緩沖液，37℃孵育15min， 接著加入100μl reconstituted Methyl SEQrTM溶液，50℃避光孵育16h。將Methyl SEQrTM吸附柱放置在回收管內(nèi)，加入混合液后4000r/min離心15min，棄廢液，ddH2O 沖洗2次，再次4000r/min離心15min，棄上層液，加入350μl的 NaOH溶液繼續(xù)孵育5min，4000r/min離心15min，棄上層液，再次用ddH2O 沖洗，之后離心處理?xiàng)壣蠈右海谖街行牡渭?0μl TE緩沖液，室溫靜置 5min，4000r/min離心2min，收集液體。(2)根據(jù)CLDN4基因序列信息，利用 Methyl Primer Express v1.0軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，一對(duì)為甲基化引物(M)：上游引物:5′-CTACCGATAAAAACCGTCACG-3′，下游引物:5′-GTGTATTTTGCGAACGTTAAGTTC-3′；另一對(duì)為非甲基化引物(U)：上游引物:5′-AATATTACTACCAATAAAAACCATCACAC-3′，下游引物:5′-TGTATTTTGTGAATGTTAAGTTTGT-3′。以修飾后DNA為模板，用兩對(duì)引物分別進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系包括：修飾后DNA模板1μl，上、下游引物(10mmol/L)各1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，Taq 酶 0.5μl, ddH2O補(bǔ)至25μl。擴(kuò)增條件為：95℃ 3min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

結(jié) 果

1.苯丁酸鈉對(duì) Hep-2細(xì)胞增殖的影響：經(jīng)0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L的苯丁酸鈉處理Hep-2細(xì)胞24h后，MTT檢測細(xì)胞增殖情況。與對(duì)照組(0mmol/L)比較，不同濃度苯丁酸鈉對(duì) Hep-2細(xì)胞的增殖均有抑制作用，且細(xì)胞增殖抑制率隨苯丁酸鈉濃度增加而升高(P<0.01)，即呈劑量依賴性，詳見圖1。

2.苯丁酸鈉對(duì) Hep-2細(xì)胞周期的影響：通過流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)不同濃度的苯丁酸鈉處理Hep-2細(xì)胞24h細(xì)胞周期的變化，與對(duì)照組(0mmol/L)比較，不同濃度苯丁酸鈉處理 Hep-2細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，而S期細(xì)胞比例顯著下降(P<0.01,圖2)。

3.苯丁酸鈉對(duì) Hep-2細(xì)胞凋亡的影響：用流式細(xì)胞儀檢測不同濃度的苯丁酸鈉處理Hep-2細(xì)胞24h的凋亡百分率。與對(duì)照組(0mmol/L)比較，隨著苯丁酸鈉濃度增大，細(xì)胞凋亡率逐漸增高(P<0.01),詳見圖3。

4.苯丁酸鈉對(duì) Hep-2細(xì)胞caspase-3 表達(dá)的影響：Hep-2細(xì)胞用4.0mmol/L的苯丁酸鈉處理后，細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測caspase-3 表達(dá)，對(duì)照組(0mmol/L)的Hep-2細(xì)胞中caspase-3無表達(dá)，4.0mmol/L的苯丁酸鈉處理Hep-2細(xì)胞24h后，caspase-3在細(xì)胞中表達(dá)顯著增強(qiáng)(圖4)。

5.苯丁酸鈉對(duì) Hep-2細(xì)胞CLDN4蛋白表達(dá)的影響：利用 Western blot法檢測不同濃度的苯丁酸鈉處理Hep-2細(xì)胞 24h后CLDN4蛋白表達(dá)情況，對(duì)照組(0mmol/L)中CLDN4蛋白幾乎不表達(dá)，經(jīng)過苯丁酸鈉處理后，CLDN4蛋白開始表達(dá)，且CLDN4 表達(dá)水平隨苯丁酸鈉濃度增加而升高，呈劑量依賴性(P<0.01),詳見圖5。

6.苯丁酸鈉對(duì) Hep-2細(xì)胞DNMT1、DNMT3a mRNA表達(dá)的影響：采用qRT-PCR檢測不同濃度的苯丁酸鈉處理Hep-2細(xì)胞24h后，細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶 DNMT1、DNMT3a mRNA的表達(dá)。與對(duì)照組(0mmol/L)比較，不同濃度苯丁酸鈉處理后，細(xì)胞中 DNMT1、DNMT3a mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)，且呈劑量依賴性(P<0.01),詳見圖6。

7.苯丁酸鈉對(duì) Hep-2細(xì)胞CLDN4基因甲基化的影響：2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，對(duì)照組(0mmol/L)Hep-2細(xì)胞甲基化和非甲基化都可擴(kuò)增出特異性亮度條帶，說明CLDN4基因均表達(dá)。0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L的苯丁酸鈉處理Hep-2細(xì)胞24h后，隨著苯丁酸鈉濃度增加，非甲基化CLDN4的表達(dá)增加，并抑制了甲基化CLDN4 的表達(dá)，當(dāng)苯丁酸鈉濃度達(dá)到4.0mmol/L與8.0mmol/L時(shí)，甲基化CLDN4幾乎不表達(dá)，詳見圖7。

討 論

喉頭在人體內(nèi)具有重要的生理功能，如發(fā)聲、呼吸、粘連、嗅覺和味覺等，LSCC嚴(yán)重影響了喉頭的正常功能，約占所有喉頭惡性腫瘤的85%～90%，已成為全世界常見的第11大癌癥類型[3]。由于大多數(shù)LSCC患者在診斷時(shí)已處于晚期且致死率較高，因此，探索LSCC的分子機(jī)制并尋找新靶點(diǎn)與新藥物將會(huì)有助于提高LSCC的綜合診治水平。

苯丁酸鈉作為一種低分子量脂肪酸，可協(xié)助基因翻譯后修飾與折疊，能夠抑制淋巴瘤、肝癌、胃癌、腦腫瘤等一些惡性腫瘤的進(jìn)展[7,12]。Paskova等[13]研究發(fā)現(xiàn)，苯丁酸鈉可以降低前列腺癌細(xì)胞LNCap與C4-2的活力，并降低其黏附力。劉奇等[14]通過不同濃度苯丁酸鈉作用胃癌細(xì)胞株 SGC-7901后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長和分化能力明顯受到抑制，G0/G1期明顯增加，且呈時(shí)間和劑量依賴性。本研究結(jié)果顯示，苯丁酸鈉能抑制喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖，使細(xì)胞G0/G1期阻滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這與苯丁酸鈉作用其他腫瘤細(xì)胞的結(jié)果是一致的。

CLDN4是緊密連接蛋白的重要組成部分，具有抑制腫瘤發(fā)生與發(fā)展的作用，例如CLDN4 可有效地抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[15,16]。然而，CLDNs在腫瘤組織中的表達(dá)受多種調(diào)節(jié)機(jī)制的影響，研究表明，腫瘤進(jìn)程與DNA甲基化密切相關(guān)[17]。近年來，DNA甲基化對(duì)腫瘤中CLDNs表達(dá)的調(diào)節(jié)作用已成為研究熱點(diǎn)。本研究通過甲基化特異性 PCR檢測CLDN4基因甲基化水平，結(jié)果顯示Hep-2細(xì)胞中CLDN4基因呈高甲基化狀態(tài)，經(jīng)過苯丁酸鈉處理后可明顯降低Hep-2細(xì)胞CLDN4的甲基化程度，促進(jìn) CLDN4基因的去甲基化，進(jìn)而促進(jìn) CLDN4蛋白的表達(dá)。

此外，DNA甲基化由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化，其中，DNMT1被認(rèn)為是一種維持性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，主要維持CpG甲基化，參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞存活等進(jìn)程[18]。DNMT3a是從頭甲基轉(zhuǎn)移酶，通常參與胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化模式的建立[19]。總之，DNMT1和DNMT3a共同參與并維持DNA甲基化。本研究中經(jīng)過鈉處理Hep-2細(xì)胞后，細(xì)胞中 DNMT1、DNMT3a mRNA表達(dá)水平被明顯下調(diào)。這提示苯丁酸鈉可能通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶促進(jìn) CLDN4基因的去甲基化，進(jìn)而抑制Hep-2細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。因此，苯丁酸鈉是一種有潛力的去甲基化生物制劑以及LSCC診治的待選藥物，但其詳細(xì)機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。