FXR基因多態性與膿毒癥的相關性研究

楊 晨 劉 瑜 陳陽希 郭 蕾 萬文輝 趙玉生 王立群 黃 方

FXR屬于核受體超家族成員之一，主要存在于在人體肝臟、腸道等器官中，在調節膽汁酸、脂質和葡萄糖平衡以及代謝等方面起著重要作用。此外，越來越多的證據表明FXR具有抗炎作用[1]。NF-κB (nuclear factor-κB)通路是炎癥過程中的經典通路，可調節多種炎性細胞因子的轉錄表達。體內和體外膿毒癥模型中NF-κB均高表達[2，3]。FXR激活后可通過干擾炎性轉錄因子NF-κB或AP-1(activator protein-1)的轉錄活性，抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素(IL) -1β、IL-2、IL-6、IL-8等的表達，從而減輕炎性反應[4～6]。研究表明，在生理狀態下將野生小鼠腸道內的FXR 基因敲除，小鼠腸道促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的mRNA 表達明顯增加。膿毒癥是重癥監護病房患者發生急性腎損傷的重要原因，脂多糖在膿毒癥發病中具有重要作用，預先給予FXR激動劑奧貝膽酸能減輕大鼠脂多糖誘導的腎臟炎癥和氧化應激，從而緩解膿毒癥相關的急性腎損傷[7]。膿毒癥的發病還與某些基因的多態性相關，如TLR (Toll-like receptor)、IL-6、CD14、TNF-α和其他炎癥相關的基因[8～10]。本文研究華北漢族人群中FXR基因中常見的SNP位點與膿毒癥易感性和臨床轉歸的相關性，為識別膿毒癥高危患者診提供依據。

資料與方法

1．基本資料：連續收集2011年6月～2012年6月中國人民解放軍總醫院急診科收住的膿毒癥患者，膿毒癥的確診參照2001年美國胸科醫師學會(ACCP)和危重病醫學會(SCCM)制定的膿毒癥診斷和分級標準，同時收集體檢中心的體檢人員作為對照組[11]。納入標準：①膿毒癥診斷明確；②年齡≥18周歲；③籍貫為北京市及其周邊地區(內蒙古自治區、天津市、山西省、河北省)的漢族人，相互之間無血緣關系；④病例資料和檢驗結果齊全。排除標準：①入院后24h內死亡；②患有AIDS、自身免疫性疾病、器官移植后、惡性腫瘤等其他特殊疾病；③存在重要器官功能衰竭及接受激素或免疫抑制劑治療；④曾使用過TNF-α抗體、INF-γ等可調節炎癥過程的細胞因子；⑤孕婦。收集所有入組患者的社會人口學資料、既往史、吸煙、飲酒史。同時還收集膿毒癥患者實驗室檢驗結果、感染部位及診斷膿毒癥的基本指標、膿毒癥24h內急性生理與慢性健康(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ, APACHE Ⅱ)評分，采用Marshall標準計算住院期間最高MODS評分、臨床結局[12]。本課題取得了中國人民解放軍總醫院醫學倫理學委員會的批準，且全部入組者或其家屬均簽訂了知情同意書。

2．方法：SNP位點的選擇和基因分型在PubMed上檢索FXR基因上與疾病相關的SNPs位點；然后通過NCBI的dbSNP數據庫查找FXR基因功能區域(3′和5′非翻譯區域、外顯子)的SNPs位點；最后在HapMap數據庫中選擇北京漢族人口樣本，并以r2>0.8為條件獲取標簽SNPs。在以上SNPs位點中，選取中國人群次要等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)大于10%的位點，最終得到rs103045411、rs10860598、rs10860603、rs11110411、rs17030270、rs17030295、rs2025801、rs35735、rs3762108、rs56163822、rs7960501共11個SNPs，其中rs3762108、rs56163822位于5′非編碼功能位點，其余均位于內含子中。入組者靜脈血DNA的提取使用德國QIAGENTM試劑盒；基因分型采用連接酶檢測反應進行(上海天昊生物科技有限公司)。

結 果

1.膿毒癥組與對照組的社會人口學資料和臨床特征：共收集膿毒癥患者310例和對照309例，最終符合條件的膿毒癥患者和對照各為303例。膿毒癥組平均年齡與對照組比較差異無統計學意義(59.35±18.79歲 vs 59.50±18.12歲，P=0.693)。其中膿毒癥組男性187例(61.72%)，女性116例(38.28%)，與對照組男性169例(55.78%)，女性134例(44.22%)比較，差異無統計學意義(P=0.137)。與對照組比較，膿毒癥組更多的合并慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)(6.93% vs 3.30%，P=0.043)。在303例膿毒癥患者中，引起膿毒癥的最常見的感染部位是肺部感染(180例，59.41%)，其次是腹腔內感染(83例，27.39%)、顱內感染(2例，0.66%)、泌尿系感染(3例，0.99%)、聯合感染(25例，8.25%)和其他感染(10例，3.30%)。微生物培養結果顯示，革蘭陰性菌(85例，28.05%)感染是常見的感染類型，其次為革蘭陽性菌感染(22例，7.26%)、真菌感染(18例，5.94%)、混合感染(76例，25.08%)及未見感染者(102例，33.66%)。器官功能障礙中呼吸系統是最常見的受累器官(172例，56.77%)，其次是循環系統(86例，28.38%)、腎臟(71例，23.43%)、肝臟(58例，19.14%)、中樞神經系統(49例，16.17%)及凝血系統(18例，5.94%)。診斷膿毒癥后24h內患者APACHE Ⅱ評分為16.51±6.06分，MODS評分為6.11±3.09分。膿毒癥患者發生膿毒性休克的有74例(24.42%)，重度器官功能障礙65例(21.45%)，住院期間死亡79例(26.07%)。

2.膿毒癥臨床轉歸特征比較：膿毒癥患者中發生膿毒性休克74例(22.42%)，非休克229例(75.58%)。休克組患者平均年齡為66.38±18.21歲，明顯高于非休克組患者的56.78±18.38歲(P=0.000)。休克組患者APACHE Ⅱ評分(21.62±5.34分 vs 14.80±5.20分)、MODS評分(9.03±2.90分 vs 5.13±2.47分)和病死率(86.49% vs 6.55%)明顯高于非休克組(P=0.000)。重度器官功能障礙組患者APACHEⅡ評分(22.06±5.36分 vs 14.97±5.22分)和病死率(36.92% vs 23.11%)明顯高于輕度器官功能障礙組患者(P=0.000)。死亡組患者平均年齡(66.63±17.24歲 vs 56.47±18.61歲)、APACHEⅡ評分(20.38±5.95分 vs 15.11±5.39分)和MODS評分(8.13±2.96分 vs 5.37±2.79分)明顯高于存活組(P=0.000)。

3.FXR基因多態性與膿毒癥易感性和臨床轉歸的相關性：所有基因位點的頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。在校正年齡、性別、BMI、吸煙飲酒狀態、基礎疾病的影響因素后，采用非條件Logistic回歸分析顯示，rs1030454 AG/AG+GG基因型發生膿毒癥的風險較AA低[OR(95%CI)分別為0.66 (0.45～0.97)，P=0.036；0.69(0.47～0.99),P=0.046]，詳見表1。rs56163822 TT較GG/GG+GT[9.77(1.40～68.15),P=0.022；9.23(1.34～63.57),P=0.04]，rs7960501 CC較TT/TT+CT[9.84(1.41～68.71),P=0.022；9.29(1.35～64.06),P=0.039]，rs17030270 GG較AA+AG[2.96(1.10～7.98),P=0.036]，rs1111041 CC較TT+TC[2.39(1.10～5.18),P=0.028]，rs17030295 TT較CC/CC+CT[10.30(1.48～71.90),P=0.019；9.29(1.35～64.06),P=0.039]，T較C[2.08(1.05～4.12),P=0.035],rs35735 TT較GG/GG+GT[3.10(1.03～9.36),P=0.048；3.67(1.27～10.57),P=0.019]發生重度器官功能障礙的風險高。rs1030454 AG+GG較AA[0.45(0.23～0.91),P=0.026]、G較A發生重度器官功能障礙的風險低[0.59(0.36～0.96),P=0.034]，詳見表2。rs35735 GT/GT+TT較GG[2.21(1.18～4.13),P=0.015；2.17(1.19～3.96),P=0.01]、T較G[1.70(1.09～2.65),P=0.018]死亡風險增高，詳見表3。未發現變異與膿毒性休克相關。

表1 FXR基因多態性與膿毒癥易感性的相關性[n(%)]

表2 FXR基因多態性與器官功能障礙的相關性[n(%)]

續表2

表3 rs35735 FXR基因多態性與死亡的相關性[n(%)]

討 論

膿毒癥目前仍是世界范圍內因感染死亡的最主要原因，其發病機制尚未完全闡明。近年來，一些代謝相關核受體，如過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors,PPAR)、肝臟X受體(liver X receptors, LXR)、FXR等的炎癥保護作用引起了高度關注，可能成為感染性疾病和自身免疫性疾病治療的新靶點[13～16]。既往在這一研究人群中發現，PPAR基因多態性與膿毒癥易感性和重度器官功能障礙相關[17]。目前，還未見關于FXR基因多態性與膿毒癥相關性的報道。

本研究在華北漢族人群中分析FXR基因上11個常見SNP位點與膿毒癥的相關性，結果顯示有7個SNP位點與膿毒癥相關。rs1030454(A→G)能降低膿毒癥和重度器官功能障礙的發生風險。rs35735 (G→T)發生重度器官功能障礙和死亡的風險升高。rs56163822 (G→T)、rs7960501(T→C)、rs17030270 (A→G)、rs11110411(T→C)、rs17030295(C→T)發生重度器官功能障礙的風險增高。尚未發現SNP位點與膿毒性休克存在相關性。

FXR基因11個SNP中，rs56163822和rs3762108是兩個非編碼功能位點，其他9個均位于內含子。FXR基因中非同義(non-synonymous)SNP罕見，提示FXR是遺傳上非常保守的基因，對于維持器官功能和細胞穩態具有重要功能[18]。本研究中未發現rs3762108與膿毒癥相關。陽性位點中rs56163822是位于FXR基因外顯子3中、靠近轉錄起始位點的一個常見的、非編碼功能多態。Liu等[19]曾指出中國人群中該位點突變率為14%，本研究對照組中該位點突變率為14.03%，與其相近。rs56163822的T 基因攜帶者相對于G/G 基因型個體肝臟中靶基因SHP 表達明顯下降，而與另一靶基因BSEP 的表達則不相關，表明此位點對靶基因的表達的影響具有選擇性[20]。Lut等[21]在白種人群中發現rs56163822 T能增加肝硬化腹腔積液患者自發性細菌性腹膜炎的發生風險。Kovacs等[22]研究結果提示在墨西哥男性人群中rs56163822 T對膽石癥具有保護作用。而本研究中rs56163822 TT發生嚴重器官功能障礙的風險分別是GG和GG+GT的9.77倍和9.23倍，與膿毒癥預后相關。研究表明，rs56163822(G→T)能夠減少FXR mRNA翻譯和降低對靶基因的轉錄功能[18]。而FXR不需要直接與靶基因結合，主要是通過干擾NF-κB、AP-1對靶基因的轉錄產生抗炎作用[4～6]。因此，推測rs56163822(G→T)通過減少FXR mRNA翻譯和表達來影響膿毒癥預后。本研究其他陽性位點(rs1030454、rs1111041、rs17030270、rs17030295、rs35735、rs7960501)均位于內含子中，且既往研究中較少報道。

綜上所述，本研究首次在華北漢族人群中證明FXR基因上存在多個與膿毒癥易感性和臨床轉歸相關的SNPs位點，提示FXR基因多態性在膿毒癥中具有重要作用。在基因水平的研究，可深度了解膿毒癥復雜的發病機制，早期識別膿毒癥高危患者，為膿毒癥患者提供個性化治療方案。未來還需擴大樣本量、擴大研究人群，從而進一步驗證所得結果，為膿毒癥的診療提供新思路。