不同成肌誘導(dǎo)液對人尿源干細(xì)胞體外成肌分化的探究

李鳳雯 姜之歆 王從容

間充質(zhì)干細(xì)胞因其自我更新能力強(qiáng)，具備多向分化潛能，在組織工程學(xué)上的應(yīng)用十分廣泛[1～3]。2008年由Zhang等[4]首次從尿液中分離獲得的一種具有多種分化潛能、符合間充質(zhì)干細(xì)胞特征的人尿源干細(xì)胞(human urinary stem cells, hUSC)，尿液取材方便，安全無創(chuàng)，在基礎(chǔ)研究中有一定的應(yīng)用前景。hUSC具有成脂、成骨、成軟骨的3系分化能力。既往研究顯示特定誘導(dǎo)液能將hUSC分化成神經(jīng)細(xì)胞，但是hUSC 定向成肌分化的能力尚不完全清楚[5]。為進(jìn)一步確定hUSC的成肌分化能力，本研究結(jié)合既往文獻(xiàn)，篩選以及調(diào)整成肌誘導(dǎo)液的相關(guān)成分，對hUSC進(jìn)行定向成肌分化進(jìn)行探索性研究。

對象與方法

1.對象：由3名成年男性健康志愿者留取尿液，留取過程符合上海市第六人民醫(yī)院倫理學(xué)委員會規(guī)定。志愿者留取清潔中段尿液約200ml，用于后續(xù)提取。

2.方法：(1)hUSC分離和培養(yǎng)：留取無菌中段尿200ml后，加5ml青鏈霉素混勻后，超凈工作臺內(nèi)分裝至4支50ml無菌管。2000r/min離心10min后棄上清，加入20ml PBS依次清洗各管中的殘余液體，吹打混勻后，再2000r/min離心10min。之后棄上清，用12ml培養(yǎng)基吹打混勻，將懸液加入預(yù)先用0.1%明膠包被的6孔板中，每孔2ml。最后，放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中觀察。每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，直至克隆形成。待克隆團(tuán)塊融合至80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代擴(kuò)增。(2)hUSC表面標(biāo)志物的鑒定：選取P5代人尿源干細(xì)胞, PBS 洗滌2遍,加0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來,離心收取細(xì)胞。用1%牛血清白蛋白(BSA)洗滌后重懸細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為106/ml。取細(xì)胞懸液 200μl加入藻紅蛋白標(biāo)記的單克隆抗體CD29、CD73、CD90、CD34,以及異硫氰酸熒光素標(biāo)記的單克隆抗體 CD44、CD45 至各流式管,并以相應(yīng)的光標(biāo)記的IgG 抗體為同型對照組。冰上避光孵育30min, 孵育后 2000r/min離心5min,使用PBS清洗游離體,2000r/min 再次離心5min。最終用1% BSA 重懸細(xì)胞至 200μl,經(jīng)Guava easyCyte(美國Millipore公司)流式細(xì)胞儀檢測。(3)不同成肌誘導(dǎo)液的配置：A成肌誘導(dǎo)液：經(jīng)典成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基+10μmol/L 5-氮雜胞苷(只處理前24h)[6]；B成肌誘導(dǎo)液：DMEM高糖完全培養(yǎng)基+10μmol/L 5-氮雜胞苷(只處理前24h)+0.1ng/ml MyoD+2ng/ml IGF-1+0.1ng/ml TGF-β3；C成肌誘導(dǎo)液：DF-12完全培養(yǎng)基+10μmol/L 5-氮雜胞苷(只處理前 24h)+0.1ng/ml MyoD+2ng/ml IGF-1+0.1ng/ml TGF-β3；D成肌誘導(dǎo)液：高糖DMEM+10% FBS+5%馬血清+20μmol/L L-Glu+50μmol/L氫化可的松+0.1μmol/L地塞米松[7]。(4)成肌誘導(dǎo)分化：選取P5代hUSC，以5×104/ml接種在6孔板上，待細(xì)胞融合至90%，分別進(jìn)行誘導(dǎo)分化。對照組不進(jìn)行成肌誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)液每3天換1次,誘導(dǎo)至第28天,倒置顯微鏡下觀察各誘導(dǎo)液中細(xì)胞形態(tài)變化。(5)誘導(dǎo)分化不同時間點(diǎn)成肌基因desmin和MyHC的mRNA表達(dá)水平測定：誘導(dǎo)第14天及第28天用PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)板，收取對應(yīng)天數(shù)的細(xì)胞板。利用 TIANGEN總 RNA 提取試劑盒進(jìn)行送檢樣品總 RNA 的提取，期間進(jìn)行去 DNA 處理。利用TaKaRa Prime script RT reagent kit with gDNA Eraser(perfect real-time)試劑盒進(jìn)行總RNA的反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)參照 AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)反應(yīng)體系, 最終由LightCycler 480 system測算CT值。引物定量標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)內(nèi)參 GAPDH。基因的引物序列Primer-BLAST 在線設(shè)計(jì)獲得,由上海生物工程有限公司合成,正反向引物序列：GAPDH正向引物:5′-GGTGTGAACCATGAGAAGTATG-3′,反向引物:5′-GAGTCCTTCCACGATACCAAAG-3′；desmin正向引物:5′-ACCATCGCGGCTAAGAACAT-3′,反向引物:5′-AATCGGTCCTCCAATTCCCG-3′；MyHC正向引物:5′-CCGTCAGCACCGTGTCTT-3′,反向引物:5′-TGCGGATGAATTTGCCGAATC-3′。

結(jié) 果

1.hUSC細(xì)胞形態(tài)：正常人尿液沉渣細(xì)胞經(jīng)hUSC完全培養(yǎng)基重懸后接種在六孔板上，次日觀察是否污染。經(jīng)過10天左右的觀察，有米粒或是短梭形克隆出現(xiàn)，貼壁生長(圖1A)。然后PBS清洗后，更換培養(yǎng)基。再經(jīng)過3～4天的擴(kuò)增生長，細(xì)胞克隆形成一個較大群落(圖1B)，可進(jìn)行胰酶消化傳代，得到P1細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)過多次傳代后，細(xì)胞活性以及形態(tài)未發(fā)生明顯改變。

2.流式細(xì)胞術(shù)檢測hUSC表面標(biāo)志物：P5代hUSC表面標(biāo)志物鑒定結(jié)果見圖2。CD29為99.8%，CD34為1.0%,CD44為99.8%,CD45為0.7%,CD73為99.9%, CD90為99.5%。符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物特征。

3.hUSC在不同成肌誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化過程中的形態(tài)學(xué)變化：使用4種不同配制的誘導(dǎo)液成肌誘導(dǎo)28天后，細(xì)胞形態(tài)與未誘導(dǎo)時比較，出現(xiàn)以下變化(圖3)。細(xì)胞間排列更緊密，hUSC由米粒或長梭形逐漸伸展變長，呈現(xiàn)肌細(xì)胞形態(tài)，可見肌管樣細(xì)胞，其中經(jīng)B和C成肌誘導(dǎo)液誘導(dǎo)的細(xì)胞，折光性更強(qiáng)，臨近細(xì)胞相互融合，形成類似肌管樣結(jié)構(gòu)(圖3中C、D)。

4.誘導(dǎo)分化不同時間點(diǎn)成肌基因結(jié)蛋白(desmin)和肌球蛋白重鏈(MyHC)的mRNA表達(dá)：成肌誘導(dǎo)分化第14天以及第28天時細(xì)胞desmin的表達(dá)量均較對照組顯著上調(diào)(P<0.05)。第14天時，A、B、C 和 D 成肌誘導(dǎo)液中細(xì)胞 desmin基因表達(dá)水平分別是未分化狀態(tài)下的3.03、4.19、3.23、1.28倍；成肌分化第28天，各成肌誘導(dǎo)液中細(xì)胞desmin基因表達(dá)水平的趨勢與第14天基本一致，其中B成肌誘導(dǎo)液組較對照組增高6.43倍(圖4A)。此外，4種成肌誘導(dǎo)液第14天及28天成肌分化中細(xì)胞MyHC基因表達(dá)均顯著高于對照組(P<0.05)。第14天A、B、C 和 D 成肌誘導(dǎo)液成肌分化下細(xì)胞MyHC表達(dá)水平分別是對照組的13.08、16.03、31.54、7.93倍；第28天各組細(xì)胞中MyHC表達(dá)水平分別是對照組的22.93、107.91、191.98、10.65倍(圖4B)。

討 論

hUSC相較于其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，取材方便無創(chuàng)，有望成為細(xì)胞治療的種子細(xì)胞[8]。然而 hUSC成肌分化的研究還不成熟，目前主要借助于市場上已有的用于其他干細(xì)胞的成肌誘導(dǎo)液。本研究利用4種不同成肌誘導(dǎo)液培養(yǎng)hUSC，觀察其分化14天以及28天成肌特異基因表達(dá)。成肌基因表達(dá)產(chǎn)物包括肌源性標(biāo)志蛋白desmin和MyHC。desmin為肌細(xì)胞的中間絲蛋白，正常分布于平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞，是肌細(xì)胞分化最早標(biāo)志物。MyHC是肌球蛋白的基本組成單位，出現(xiàn)在肌細(xì)胞發(fā)育分化末期。本研究發(fā)現(xiàn)4種成肌誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化第14天，結(jié)蛋白的mRNA表達(dá)水平分別是對照組的3.03、4.19、3.23、1.28倍，其中B成肌誘導(dǎo)液中desmin顯著表達(dá)。而分化末期即28天后，成肌誘導(dǎo)液分化下細(xì)胞MyHC mRNA表達(dá)水平是對照組的22.93、107.91、191.98、10.65倍。本研究未檢測到成肌基因MyoD、Myogenin的基因表達(dá)，既往文獻(xiàn)報道這兩個基因在骨骼肌的表達(dá)量較低，無法檢出或由于該基因本身的表達(dá)量較低。此外，成肌誘導(dǎo)28天后，經(jīng)B和C成肌誘導(dǎo)液誘導(dǎo)的細(xì)胞，折光性更強(qiáng)，細(xì)胞有融合現(xiàn)象，類肌管樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。整體而言，4種成肌誘導(dǎo)液均可誘導(dǎo)hUSC的成肌分化，B和C成肌誘導(dǎo)液在分化效果上優(yōu)于另外兩種。其中，C成肌誘導(dǎo)液終末分化效果最佳。

5-氮雜胞苷法是誘導(dǎo)細(xì)胞成肌分化的常見方法。其原理是阻止新復(fù)制DNA的胞嘧啶甲基化，激活原本轉(zhuǎn)錄失活的成肌基因[9]。研究表明10μmol/L的5-氮雜胞苷不僅可以控制藥物本身對干細(xì)胞產(chǎn)生的毒性，還獲得較高的成肌誘導(dǎo)率[10]。此外，細(xì)胞因子包括胰島素樣生長因1(IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等都影響成肌分化。前者通過激活骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，增加PI3K水平，減少骨骼肌纖維化等提升成肌分化能力[11～14]。而TGF-β通過衛(wèi)星細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答強(qiáng)度，從而參與肌肉修復(fù)的調(diào)節(jié)[15]。成肌調(diào)節(jié)因子MyoD作為骨骼肌細(xì)胞分化的開關(guān)基因，誘導(dǎo)的增強(qiáng)子RNA與hnRNPL相互作用，在成肌分化過程中激活靶基因轉(zhuǎn)錄，激活骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，促進(jìn)成肌分化[16，17]。本研究采用了4種不同成分的成肌誘導(dǎo)液，A、B、C成肌誘導(dǎo)液均采用含10μmol/L 5-氮雜胞苷的完全培養(yǎng)基進(jìn)行前24h的干預(yù)，B和C成肌誘導(dǎo)液中又都添加了細(xì)胞因子IGF-1、TGF-β、成肌調(diào)節(jié)因子MyoD，其分化完成后的成肌能力也更為明顯。而D成肌誘導(dǎo)液則借助馬血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)成肌分化。B和C成肌誘導(dǎo)液的最大不同主要在于B成肌誘導(dǎo)液采用DMEM高糖完全培養(yǎng)基而C成肌誘導(dǎo)液則選用DF-12完全培養(yǎng)基，DF-12培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分更為豐富，或在分化期間更促進(jìn)成肌進(jìn)程。

綜上所述，本研究利用不同成分的成肌誘導(dǎo)液對 hUSC進(jìn)行成肌分化，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)以及成肌特異基因表達(dá)，4種成肌誘導(dǎo)液在一定條件下均可將 hUSC分化成肌細(xì)胞，其中，C成肌誘導(dǎo)液效果更顯著。目前尚需開展進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證 hUSC在成肌分化甚至細(xì)胞治療上的價值。