自噬在腎缺血再灌注損傷中作用機制的研究進展

彭顯月 梁國標

缺血再灌注損傷(ischemic reperfusion injury, IRI)是臨床上常見且復雜的病理生理過程，是導致急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)的主要原因之一。腎IRI臨床常見于腎移植、休克后微循環再通、主要的血管外科手術以及體外循環等，其發病機制尚未完全闡明[1]。目前認為腎IRI與氧自由基生成、鈣離子超載、ATP減少和凋亡等機制有關。近年來有研究表明，通過調節細胞自噬(autophagy)可以減輕腎IRI，提示自噬可能成為腎IRI治療的新切入點[2]。

自噬是維持機體內環境平衡的重要生理過程，它是一個多方面、連續的過程，由一系列高度保守的細胞自噬相關蛋白(Atgs)參與并通過多種信號通路構成自噬的分子機制[3]。研究發現，自噬在腎IRI的發生、發展中發揮著重要的作用，一方面適度的自噬能抑制炎性因子的釋放,另一方面過度的自噬能加重細胞損傷。因此對自噬的調節可能成為腎IRI治療的新策略。

一、自噬的基本概述

自噬這一現象最早由比利時科學家Christian de Duve發現并提出,他在觀察細胞時發現有一種新型的囊泡可運輸細胞貨物進入溶酶體進行降解，而這種新的囊泡被稱為自噬體，Duve創造了自噬這個詞來形容這一過程。2016年諾貝爾生理學或醫學獎獲得者大隅良典培育出因突變而缺乏液泡降解酶的酵母細胞，并通過饑餓來激發自噬。隨后有研究者在此基礎上進一步研究發現，細胞自噬通過對細胞部件的降解和回收利用參與了許多重要的生理功能(如脂質代謝、蛋白質聚集體降解和RNA降解等)。

自噬的標志是雙層膜結構的自噬小體的形成，主要包括誘導、成核、延伸和完成4個步驟。根據自噬發生的分子機制、功能的不同可將自噬分為巨自噬、分子伴侶介導的自噬和微自噬。巨自噬指細胞在饑餓、缺氧等刺激誘導下，細胞質內產生雙層囊泡結構包裹非特定蛋白形成自噬體，隨后自噬體與溶酶體融合，最終將自噬體包裹的物質降解的過程。分子伴侶介導的自噬是指具有特定基序的蛋白質被分子伴侶識別后，與溶酶體膜上的特殊受體——溶酶體相關膜蛋白結合，進入溶酶體被降解的過程。微自噬是指溶酶體或液泡膜直接內陷包裹胞質物或者細胞器進行降解的過程。目前關于巨自噬的研究最為廣泛，與腎IRI的發生、發展最為緊密。

二、自噬對腎缺血再灌注損傷的影響

自噬是維持腎臟固有細胞內穩定、細胞活力和生物學功能的重要生理機制。大量研究證實自噬參與了腎IRI的發生、發展，但其在腎小管細胞中的作用仍存在爭議，特別是在急性腎損傷模型中[1，4]。IRI是AKI的主要原因，腎近端小管細胞對氧化應激非常敏感，是氧化應激介導的急性腎損傷的重要靶點，在缺血再灌注(IR)后常導致小管細胞壞死[5]。特別是在由IR引起的AKI等病理狀態下，自噬在小管細胞維持其完整性的機制中發揮著不可替代的作用[6]。然而，一些研究者認為，IR后產生的過量自噬對腎細胞有害，并可能導致IR中的自噬性細胞死亡[7]。通過對近端小管細胞和體外小鼠腎IR模型的研究發現，自噬在缺血期不太明顯，在再灌注期顯著增強[8]。由此可知，自噬是一個動態過程，它在腎IRI中的作用受多種病理生理環境因素的影響并在腎IRI中發揮著重要作用。

三、腎缺血再灌注損傷中自噬的調控

近年來，自噬在缺血再灌注損傷領域的研究一直是一個熱點，缺血再灌注損傷的機制如氧化應激、凋亡、炎癥、內質網應激等均可誘導自噬的發生。自噬也在一定程度上參與IRI并發揮著一定的作用。

1．線粒體自噬的調控：目前調控線粒體自噬的通路主要有以下3條:①PINK1(PTEN-induced kinase1)/Parkin通路；②BNIP3/NIX(NIP3-like protein X)通路；③FUNDC1(FUN14 domain containing 1)通路。其中后兩條通路主要是通過線粒體外膜蛋白直接與LC3相結合發揮作用。PINK1/Parkin通路主要參與哺乳動物線粒體自噬的調控，PINK1和Parkin分別是絲氨酸/蘇氨酸激酶和E3泛素連接酶[8]。當線粒體功能正常時，PINK1通過線粒體膜上的轉位酶轉移到線粒體基質進行降解；當線粒體受損后，Parkin能被絲氨酸/蘇氨酸激酶PINK1磷酸化，促使其由胞質轉移到線粒體膜外，從而被選擇性地募集到受損的線粒體，緊接著通過介導線粒體膜蛋白的泛素化而參與線粒體自噬[9]。哺乳動物雷帕霉素靶點(mammalian target of rapamycin, mTOR)，是一種重要的線粒體自噬調控因子，它的激活可抑制細胞的線粒體自噬[10]。雷帕霉素能夠抑制mTOR的功能，減弱mTOR對線粒體自噬的負性調節，并通過激活線粒體自噬減輕IR導致的腎損傷[3]。

2.內質網應激自噬的調控：內質網(endoplasmic reticulum, ER)應激誘導的自噬介導了一種適應性反應，可在體外保護機體免受氧化和ATP耗竭誘導的細胞毒性，并在體內改善IRI[11]。在ER腔中，新合成的蛋白質在離開ER之前折疊到細胞的不同區域和細胞外空間。當ER受到不利條件刺激時，蛋白質被錯誤地折疊，且過早錯誤折疊的蛋白質不能從ER腔中排出并在ER中累積，導致ER應激[12]。細胞通過激活高度保守的未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)促進ER應激，促進修復以重建正常的ER功能[13]。ER跨膜蛋白的UPR包括需肌醇酶1(lnositol-requiring kinase 1, IRE1)、蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase, PERK)和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)，可同時觸發促生存和促死亡通路[14]。ER應激可誘導包括腎上皮細胞在內的哺乳動物細胞自噬[15]。在ER應激時，細胞通過激活諸如UPR和自噬信號轉導通路進行調控，以確保細胞內環境穩定。UPR和相關的ER伴侶蛋白Grp78已被證明主要參與誘導自噬[16]。UPR相關的PERK通路可上調Atg12并將LC3-Ⅰ轉化為LC3-Ⅱ；IRE1通路可從Bcl-2復合物中釋放Beclin1以促進自噬誘導。此外，內質網是Ca2+儲存庫，其在應激期間可將大量的Ca2+釋放到胞質中，從而抑制mTOR信號通路的活性，允許自噬體以Beclin1和Atg7依賴的形式大量產生，促進自噬[17]。自噬通過上述信號通路清除內質網應激反應產生的受損蛋白和細胞器等來減輕細胞損傷和腎IRI。

自噬在炎癥損傷過程中可通過抑制炎性復合物或清除受損的蛋白質和細胞器減輕炎癥損傷。有研究證實炎性介質IL-6、IL-10、HMGB1和TNF-α均參與了自噬在腎IR后的調控，可誘導自噬的產生。Chen等[22]的研究表明，在TLR(Toll-like report)介導的信號通路中，上調HMGB1可激活TLR4信號通路的調節，刺激炎癥和免疫反應加劇腎IRI。然而，TLR又可通過促進MyD88或TRIF與Beclin1相互作用，抑制Beclin1-Bcl-2復合體形成從而促進自噬[23]。此外，NOD樣受體(NOD-like receptor, NLR)介導的通路能參與炎性反應的正向調節，NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)是NLR家族成員之一，激活時可促進炎性因子如IL-1β、IL-18的釋放[23]。NLRP3介導的炎性反應可激活小G蛋白RalB ，活化的RalB可同時與Exo84、ULK1-PI3KC3復合體結合形成一個多蛋白復合物來誘導自噬[23]。這樣，自噬在氧化應激和炎性反應中被激活，吞噬受損的蛋白和細胞器，從而減輕機體損傷。

四、自噬對腎缺血再灌注損傷的雙重作用

1.自噬減輕缺血再灌注引起的腎小管上皮細胞損傷：越來越多的證據支持自噬通過抑制細胞凋亡來預防腎小管細胞IRI。在這方面Jiang等[3]的研究表明，通過ptdlns3k抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)或小干擾RNA(siRNA)對Beclin1或Atg5轉錄體的自噬抑制，可增加缺氧/復氧條件下體外大鼠近端小管細胞的凋亡。在體內，3-MA和溶酶體抑制劑氯喹在30min的雙側腎缺血小鼠模型中加重了48h灌注后腎細胞的損傷。自噬缺陷(近端腎小管特異性Atg7敲除)小鼠雙側腎缺血25min后也觀察到類似的結果。此外，兩種不同的近端小管特異性Atg5敲除小鼠模型，在雙側腎缺血25min或35min后，也觀察到腎臟損傷的加劇，細胞凋亡增加以及p62和泛素陽性包涵體的積累[5]。

2.自噬加劇缺血再灌注引起的腎小管上皮細胞損傷：盡管有充分的證據表明自噬有保護作用，但自噬在腎IRI過程中也有不利影響。Chien等[24]用單側腎切除的大鼠模型，通過腺病毒傳遞Bcl-2家族蛋白Bcl-2和Bcl-xL，保護另一側腎臟免受IRI(缺血45min)，這一效應被認為是由這些蛋白的抗凋亡和抗自噬特性介導的。在過表達Bcl-2的轉基因小鼠中，也觀察到了Bcl-2的保護作用，當這些動物雙側腎缺血45min后，凋亡和自噬功能均下降。此外，在缺血和重復性缺氧預處理保護作用的研究中，觀察到自噬在單側腎缺血45min大鼠模型中的表達也是降低的。由此可見，在腎IRI中自噬的激活和過度激活受多種因素的影響并發揮著截然相反的作用。自噬在腎缺血再灌注損傷中的確切作用為什么難以確定可能與自噬本身的動態性、動物模型的缺血階段、造模時間、動物模型年齡、藥物種類及劑量等的不同有關，這將在今后的研究中進一步加以證實[3，5]。

五、展 望

自噬是細胞存活與死亡的核心因素之一，在腎IRI中發揮著重要作用。激活自噬既可以對受損腎小管上皮細胞起保護作用，又可能加重腎組織損傷，筆者認為這可能與自噬激活的方式、程度、缺血時間、階段和個體差異等因素有關。雖然自噬與腎IRI相互作用關系仍存在著矛盾與爭議，但自噬在腎IRI中的作用不可否認。從自噬的角度研究腎IRI的過程,深入了解該疾病的發病機制，發現潛在的藥物治療靶點是目前重要的研究方向。