尖孢鐮刀菌及歐文氏桿菌復合侵染引起的半夏腐爛病研究

姚天明，伏建增，南建軍，曲丹妮，田 雨，耿甜甜

（1.天水農業學校，甘肅 清水 741400；2.西北師范大學，甘肅 蘭州 730070）

半夏［Pinellia ternata（Thunb）Breit］以塊莖入藥，具有潤燥化痰、降逆止嘔、消痞散結之功，為常用大宗中藥材［1］。我國年產干半夏約6 500 t，甘肅西和縣和清水縣是全國半夏的主要產區，約占總產的70%左右［2］。半夏塊莖腐爛病是半夏生產中的主要威脅，輕則減產10%～20%，重則絕收，主要危害維管束。在發病初期，半夏葉柄出現一條鐵銹色紅線，塊莖芽頭腐爛，葉脈失綠，葉片發黃，呈花葉狀，7～10 d后葉片如水燙狀，塊莖嚴重腐爛并伴有惡臭味，皮層破裂失水后呈豆腐渣樣。田間濕度大時傳播速度快，甚至整田絕收。我們對半夏腐爛病進行了分離、提純、鏡檢、回接、藥敏及田間試驗，以期找出行之有效的防治方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

半夏樣本采自清水縣半夏種植基地。2019年5—8月采集健康半夏、發毛半夏（半夏塊莖表面附著灰白色鐮刀菌絲）和腐爛半夏。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離提純 取供試材料用自來水沖洗24 h，70%乙醇浸泡30 s，無菌水洗3次，再用2%次氯酸鈉浸泡2 min，無菌水洗5次，用無菌干燥濾紙吸干樣品表面水分。在超凈工作臺上用滅菌撥針挑取健康半夏芽頭內組織塊、發毛半夏芽頭內組織塊和腐爛半夏病健交接組織塊各5 mm×5 mm分別研磨。吸取1 mL無菌水制成菌懸液，然后分別稀釋為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6菌懸液備用。PDA和NA培養基在121℃下滅菌30 min，不同濃度菌懸液接種后置于28℃的恒溫箱中培養48 h，選取有10～20個獨立菌落的培養皿，對各菌落進行分類計數、鏡檢，最后對符合鐮刀菌和歐文氏桿菌的特征菌落進行提純。

1.2.2 回接試驗 回接試驗設4個處理，分別為處理1，尖孢鐮刀菌；處理2，歐文氏桿菌；處理3，先接尖孢鐮刀菌，培養3 d后再接歐文氏桿菌；處理4（CK），加無菌水。

接種時，選取健康的直徑約1 cm的半夏塊莖，用自來水沖洗10 min，70%乙醇浸泡30 s，無菌水充分沖洗后，每20粒置于無菌加蓋瓶底置濾紙的直徑8 cm的玻璃瓶中，然后用無菌接種針挑取提純的各處理菌落，放入加了5 mL滅菌水的試管中充分震蕩，倒入各加蓋玻璃瓶中，貼上標簽。在25℃的恒溫箱中培養10 d，統計半夏發芽率和腐爛率。

半夏塊莖腐爛病鑒定分級調查標準：0級，無病；1級，塊莖腐爛病斑＜塊莖總面1/4；2級，塊莖腐爛病斑占塊莖總面1/4～1/2；3級，塊莖腐爛病斑占塊莖總面1/2～3/4；4級，塊莖腐爛病斑占塊莖總面3/4以上［3］。

腐爛病發病率=（腐爛病粒數/調查總粒數）×100%

病情指數=［∑（各級腐爛病粒數×該級級數）］/（調查粒數×最高級級數）

1.2.3 藥敏試驗 尖孢鐮刀菌藥敏試驗采用絲狀真菌紙片擴散法［4］。制作紙片所用藥劑分別為50%多菌靈可濕性粉劑、30%惡霉靈、50%代森錳鋅可濕性粉劑、50%福美雙可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑、15%三唑酮可濕性粉劑、430 g/L戊唑醇懸浮劑。細菌藥敏試驗采用1997年美國NCCLS對藥敏試驗紙片擴散法法規［5］。采用標準紙片和自制紙片2種，標準紙片分別為慶大霉素（GM10）、西（頭孢呋辛）、羧芐西林（CB100）、頭孢他啶（達）、哌拉西林（氧）、紅霉素（E15）、卡那霉素（K30）；自制紙片所使用的藥劑分別為80%乙蒜素1 000倍液、20%噻菌銅懸浮劑（浙江龍灣化工有限公司）500倍液、15%三唑酮可濕性粉劑（江西劍牌農化股份有限公司）500倍液、6%春雷霉素細菌一遍凈可濕性粉劑（山東韓農化學有限公司）500倍液、10%中生·氨基寡糖素（2.5%中生菌素，氨基寡糖素7.5%）500倍液、46%氫氧化銅水分散粒劑（美國杜邦公司）1 000倍液、86.2%氧化亞銅可濕性粉劑（挪威·勞道克斯公司）1 000倍液。自制紙片用不同藥劑浸濕后，置于80℃烘箱中烘干。在超凈工作臺中分別取提純的尖孢鐮刀菌、歐文氏桿菌用涂布棒涂布接種于滅菌的NA培養基上，然后每皿貼7種自制紙片，置于28℃恒溫箱中培養，48 h后觀察抑菌環的大小，測定2種菌對不同藥劑的敏感性。

紙片擴散法是WHO推進使用的微生物敏感性測定方法，能在抑菌濃度范圍內待測菌的生長被抑制，形成透明的抑菌圈。根據抑菌圈的大小可判斷待測菌對測定藥物的敏感程度，一般分為敏感（S）、中介（I）和耐受（R）3個標準。對于唑類藥物抑制鐮刀菌，R≤13 mm，14 mm≤I≤16 mm，S≥17 mm；對于腸桿菌科的細菌，不同藥物敏感程度的判定略有差異，我們以最大直徑為標準，設定測量值為R≤20 mm，21 mm≤I≤30 mm，S≥31 mm。

1.2.4 溫室盆栽試驗 采用直徑1.0～1.5 cm健康半夏塊莖做種，用430 g/L戊唑醇1 000倍液＋80%乙蒜素1 000倍液混合液處理種莖，以未處理為對照，采用對比法排列，進行催芽。盆長0.80 m，寬0.25 m，每盆種植0.3 kg，每處理種植10盆，播種后在整個生長期觀察發病情況。

2 結果與分析

2.1 各供試材料的微生物分離結果

通過對健康半夏、發毛半夏和腐爛半夏樣本進行微生物分離、鏡檢的結果（表1）可以看出，土壤中存在大量細菌，可腐生于半夏塊莖內，半夏不同塊莖細菌種類有所不同，但絕大多數植物病原細菌為革蘭氏陰性菌。革蘭氏陰性菌只檢出1種，通過查閱文獻［6］，結合田間癥狀觀察，認為是歐文氏桿菌。在腐爛半夏中未能檢出鐮刀菌絲，主要原因可能為腐爛半夏中存在大量歐文氏桿菌，歐文氏桿菌通過占位性競爭和營養競爭，抑制了尖孢鐮刀菌的生長。在發毛半夏中既檢出了尖孢鐮刀菌，又檢出了大量歐文氏桿菌，認為由于發毛半夏尖孢鐮刀菌大量生長，對半夏造成傷口，從而有利于土壤中的歐文氏桿菌的侵入，歐文氏桿菌侵入半夏后生長迅速，進而抑制了其他內生細菌的生長，所以在腐爛半夏中只檢出了歐文氏桿菌，健康半夏中檢測出尖孢鐮刀菌、放線菌、芽孢桿菌和其他革蘭氏陽性桿菌，而很少檢出歐文氏桿菌。

表1 不同半夏樣本微生物分離主要結果

2.2 尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌復合侵染回接試驗結果

從表2可以看出，單接尖孢鐮刀菌并沒有發生腐爛病，但影響半夏的發芽率。單接歐文氏桿菌的發病率有所提高，但發芽率降低。復合接種尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌的發芽率嚴重降低，腐爛率大大增加。由此表明，半夏腐爛病的發生是由尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌復合侵染形成的，其中尖孢鐮刀菌菌絲在半夏塊莖表面附著繁殖，刺傷了半夏，造成歐文氏桿菌侵染的微傷口，為歐文氏桿菌的侵染提供了條件；歐文氏桿菌在半夏塊莖內大量繁殖，產生解果膠酶和解淀粉酶，使半夏塊莖分解，造成腐爛。

2.3 歐文氏桿菌和尖孢鐮刀菌藥敏試驗結果

藥敏試驗結果（圖1、圖2、圖3）顯示，歐文氏桿菌對諾氟沙星、慶大霉素、哌拉西林和乙蒜素敏感，其中諾氟沙星、慶大霉素和哌拉西林是臨床上常用的治療腸桿菌科疾病的常用藥，而我們所得歐文氏桿菌正是腸桿菌科細菌，進一步證明了結果的正確性。乙蒜素是農業生產中的常用藥，屬于低毒生物農藥，可供防治半夏腐爛病選擇。其他幾種農藥耐受性高，應謹慎選擇。尖孢鐮刀菌對戊唑醇敏感，對三唑酮中介，對其他如多菌靈、代森錳鋅、代森鋅、惡霉靈等耐受。半夏生產上建議使用三唑類藥物。

表2 尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌的復合侵染回接試驗結果

2.4 溫室盆栽

通過溫室盆栽試驗觀察，種莖用戊唑醇和乙蒜素浸種催芽的，整個生長季沒有發病，而對照在5月中旬大量發病，發病率達40%以上，其中3盆絕收。

3 結論與討論

我們以家種健康半夏、發毛半夏和腐爛半夏為材料，對引起半夏腐爛病的尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌進行分離、提純、鏡檢、回接和藥敏試驗。結果在家種健康半夏和發毛半夏中分離出尖孢鐮刀菌，在發毛半夏和腐爛半夏中分離到歐文氏桿菌。回接試驗表明，接種尖孢鐮刀菌腐爛病發病率為0，半夏發芽率75%；接種歐文氏桿菌腐爛病發病率為20%，半夏發芽率60%；而先接種尖孢鐮刀菌，3 d后再接種歐文氏桿菌的半夏，腐爛病發病率為90%，半夏發芽率20%。藥敏試驗和盆栽實驗發現，尖孢鐮刀菌對三唑類農藥戊唑醇敏感，歐文氏桿菌對乙蒜素敏感，并具有很好的防治效果。可以得出，半夏腐爛病是由尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌復合侵染引起的。

何煜波等［7］采用針刺浸泡法對半夏軟腐病病原菌進行分離、回接以及16s DNA片段的擴增和序列分析，認為半夏腐爛病病原為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種；孫新榮等［8］通過形態學觀察和致病性測定，表明引起半夏塊莖腐爛病的病原物為尖孢鐮刀菌。我們不僅在發毛半夏中檢測出尖孢鐮刀菌，也在許多健康半夏塊莖種檢測出尖孢鐮刀菌，因此認為尖孢鐮刀菌是半夏塊莖的內生菌，營弱寄生和腐生生活；在半夏生長期，尖孢鐮刀菌在健康半夏維管束內病菌擴展是比較緩慢的，通常不發病。但由于栽培半夏播種量大，部分病籽、劣籽帶菌量大，當溫濕度環境適宜，如土溫在10℃以上，相對濕度大于80%時菌絲大量繁殖，這些菌絲再次侵染健康半夏，對健康半夏造成微傷口，而微傷口又是歐文氏桿菌侵入的入口。歐文氏桿菌存在于土壤中，既可通過自然孔口入侵，但更主要的入侵途徑是微傷口。因此認為半夏腐爛病由尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌復合侵染所致，要對半夏腐爛病進行有效防治，必須要同時抑制尖孢鐮刀菌和歐文氏桿菌。一般病害防治試驗是直接對作物施藥，然后比較發病率和嚴重度進行藥物有效性試驗，我們采用醫院檢驗科所用藥敏試驗，對藥物的篩選具有直觀、簡便和用時短的特點，通過藥敏試驗，篩選出對病原菌敏感的藥劑，然后在進行大田防治試驗，針對性強，效果好，是一種值得推廣的好方法。