強壯硬毛藻粗多糖的組成、理化性質和抗氧化活性

孫瑞彬 高夢舒 王茜

摘要：為了探究強壯硬毛藻（Chaetomorpha valida）的開發利用價值，采用糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜法測定強壯硬毛藻粗多糖的組成，分別用硫酸-咔唑法、硫化鋇-明膠比濁法測定糖醛酸、硫酸基含量，同時通過強壯硬毛藻粗多糖對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，簡稱DPPH）自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的清除作用來評價其抗氧化活性。結果表明，強壯硬毛藻粗多糖中主要的單糖鼠李糖、巖藻糖、葡萄糖的物質的量之比為 1.00 ∶ 0.11 ∶ 0.21;多糖中糖醛酸、硫酸基含量分別為5.27%、3.77%;當多糖質量濃度為1.0 mg/mL時，對DPPH·和超氧陰離子自由基的清除率最高，分別為84.5%、83.61%;當多糖質量濃度為0.2 mg/mL時，對羥自由基的清除率最高，為19.9%。由研究結果看出，強壯硬毛藻粗多糖能用于食品、醫藥及化妝品等領域。

關鍵詞：強壯硬毛藻;多糖;組成;理化性質;抗氧化活性

中圖分類號： S184 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0206-06

收稿日期：2019-06-03

基金項目：國家自然科學基金（編號：31572622）;山東省級重點實驗室專項建設計劃開放課題（編號：SDKL2017009-03）;國家海洋局海洋生物活性物質與現代分析技術重點實驗室開放課題（編號：MBSMAT-2018-04）;煙臺大學大學生創新創業訓練計劃（編號：201811066145）。

作者簡介：孫瑞彬（1998—），女，山東煙臺人，主要從事海洋生物活性物質研究。E-mail：15192344844@163.com。

通信作者：邢榮蓮，博士，副教授，主要從事海洋生物工程研究。E-mail：xingronglian@163.com。 ?海洋藻類生物的生存環境異于陸生植物，其代謝產物具有獨特的理化性質和生物活性[1]。海藻多糖具有抗氧化、抗病毒、抗細菌、抗凝血、免疫調節等功效，被廣泛應用于藥品、保健品、化妝品等領域[2]。隨著人們對抗氧化劑的認識加深以及對藻類多糖功能研究的發展，尋找天然無毒、價廉易得的抗氧化劑已經成為食品保藏技術和現代保健中不可或缺的一部分[3]。從豐富的海藻資源中尋找能開發成為天然抗氧化劑的物質已經受到國內外研究者的廣泛關注[4]。藻類多糖的研究及應用以常見種類的微藻和大型藻類為主[5]。研究發現，藻類多糖的結構組成、理化性質和活性因種類而異。馬尾藻中的多糖主要有褐藻糖膠、藻酸鹽和褐藻淀粉3類，并且從不同種馬尾藻中提取的褐藻糖膠、藻酸鹽的質量均有顯著差異[6];海帶硫酸多糖清除1，1- 二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，簡稱DPPH）的效果比紫菜硫酸多糖好[7];用碳酸鈉提取的羊棲菜多糖對自由基的清除效率比較高[7]。研究不同藻類多糖的組成、理化性質和活性對于認識該藻多糖的性質及其開發利用具有十分重要的意義。

強壯硬毛藻（Chaetomorpha valida）是一種生長速度快、易采收、不易分解的可再生資源，因不能被生物直接攝食而成為相對靜止水體（池塘、湖泊）中的雜藻[8-9]，在每年5—9月大量繁殖甚至暴發[10]。養殖水體中發現的強壯硬毛藻通常采用人工撈取后丟棄的方式處理，不僅對環境造成污染[11]，對資源也造成極大的浪費[10]。研究強壯硬毛藻的應用價值，對于提升經濟效益具有重要意義，但目前的相關研究甚少。筆者在前期研究中發現，強壯硬毛藻含有大量多糖，而對其多糖的相關研究還未見報道。因此，本文研究了強壯硬毛藻粗多糖的組成、理化性質和抗氧化活性，并探討其利用價值，旨在為強壯硬毛藻資源的開發和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

強壯硬毛藻采自山東東方海洋科技股份有限公司乳山分公司海參養殖區，帶回實驗室后去除附著于其上的貝類、藻類等，用過濾海水洗凈，晾干，粉碎，備用。試驗中所用標樣為天津市致遠化學試劑有限公司生產的分析純無水葡萄糖。

1.2 多糖的提取

稱取10 g強壯硬毛藻粉，加入200 mL蒸餾水，沸水浴提取2 h，重復操作3次，合并提取液。于 3 000 r/min 離心 20 min 以去除不溶性雜質，將上清液冷卻后，加入4倍體積的95%乙醇沉淀后離心，得強壯硬毛藻粗多糖。再將強壯硬毛藻粗糖用Sevage法[12]去除其中的蛋白質。

1.3 理化性質的測定

總糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[13]，糖醛酸含量的測定采用硫酸-咔唑法[14-15]，硫酸基含量的測定采用氯化鋇-明膠比濁法[14-15]。單糖組分的分析采用糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜法[16]。準確稱取15 mg硬毛藻粗多糖樣品，加入10 mL濃度為 2 mol/L 的三氟乙酸于磨口試管中溶解，嚴格密封，在沸水浴條件下水解4 h，將水解液真空蒸干待用。稱取10 mg標準糖和上述處理好的糖樣10 mg，分別加入10 mg鹽酸羥胺、0.5 mL吡啶、1 mg肌醇，充分溶解振搖后于90 ℃水浴中加熱反應30 min，取出混合液并冷卻至室溫，再加入0.5 mL乙酸酐，在90 ℃水浴條件下繼續反應30 min進行乙酰化，將反應產物直接進行氣相色譜分析。

1.4 抗氧化活性的測定

1.4.1 多糖對超氧陰離子自由基（ O-2 · ?）的清除作用 取1 mL質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的多糖溶液，加入4.6 mL濃度為 0.05 mol/L 的Tris-HCl（pH值為8.2），在25 ℃水浴中恒溫10 min，立即加入0.3 mL濃度為 0.06 mol/L 的鄰苯三酚溶液，搖勻，10 min后在 420 nm 波長處測得吸光度D420 nm（1）。保持其他條件不變，以等體積的去離子水代替多糖樣品溶液作為空白對照，測得吸光度D420 nm（0）[17]。以不同濃度維生素C替代多糖樣品作為陽性對照。超氧陰離子清除率的計算公式如下：

1.4.2 多糖對羥自由基（·OH）的清除作用 取 2 mL 質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的多糖溶液，分別加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 0.06 mol/mL H2O2溶液，搖勻后靜置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液靜置30 min，在510 nm處測得吸光度D510 nm（i）。其他條件不變，對照用去離子水代替多糖樣品溶液，測得吸光度D510 nm（x）;樣品對照用2 mL去離子水代替H2O2，測得吸光度D510 nm（j）[18]。用不同濃度的維生素C替代多糖樣品作為陽性對照。對羥自由基（·OH）清除率的計算公式如下：

式中：D510 nm（j）為2 mL各濃度多糖溶液、2 mL FeSO4溶液（6 mmol/L）、2 mL去離子水和2 mL水楊酸溶液（6 mmol/L）的吸光度;D510 nm（i）為待測組吸光度。

1.4.3 多糖對DPPH·的清除作用 取2 mL質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的多糖溶液，加入2 mL 0.2 mol/L DPPH溶液和2 mL H2O2溶液，搖勻，室溫避光靜置20 min，用95%乙醇對分光光度計調零，在517 nm處測得吸光度D517 nm（a）[18]。用不同濃度維生素C替代多糖樣品作為陽性對照。對DPPH·清除率的計算公式如下：

式中：D517 nm（c）為2 mL DPPH溶液+2 mL去離子水的吸光度;D517 nm（b）為2 mL 95%乙醇+2 mL多糖樣品溶液的吸光度;D517 nm（a）為待測組吸光度。

1.5 數據分析

數據采用Excel 2007和Origin 8.5軟件進行處理和分析，結果以“x±s”形式表示。用統計學方差分析來檢驗有無顯著性差異，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 理化性質的測定

結果表明，強壯硬毛藻粗多糖總糖含量為 26.77%，糖醛酸含量為5.27%，硫酸基含量為 3.77%。用氣相色譜法測得強壯硬毛藻單糖的色譜結果和3種標準樣的色譜結果，詳見圖1至圖4。圖3中的峰對應巖藻糖和本試驗中所加參照物。由圖1至圖4還可看出，強壯硬毛藻粗多糖的主要成分為鼠李糖、葡萄糖和巖藻糖，鼠李糖、巖藻糖、葡萄

糖物質的量之比為1.00 ∶ 0.11 ∶ 0.21，鼠李糖占比最高，約為葡萄糖的5倍，遠高于其他單糖。

2.2 粗多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

由圖5可以看出，不同質量濃度粗多糖對超氧陰離子自由基的清除作用與維生素C相比差異極顯著（P<0.01）。當粗多糖質量濃度為0.8～1.0 mg/mL時，清除率較高，當粗多糖質量濃度為1.0 mg/mL時，有最大清除率，達83.61%;當粗多糖、維生素C質量濃度為0.2～0.8 mg/mL 時，相同質量濃度的粗多糖、維生素C間對超氧陰離子的清除作用差異極顯著（P<0.01）;當粗多糖質量濃度為 1.0 mg/mL時，差異顯著（P<0.05）。

2.3 粗多糖對羥自由基的清除作用

經方差分析，不同質量濃度粗多糖對羥自由基的清除作用差異顯著（P<0.05）。由圖6可以看出，當質量濃度為0.2～1.0 mg/mL時，粗多糖對羥自由基的清除率差異不明顯且均不超過50%;當質量濃度為0.4～1.0 mg/mL時，相同質量濃度的粗多糖和維生素C對羥自由基的清除作用差異極顯著（P<0.01）;當質量濃度為0.2 mg/mL時，粗多糖、維生素C對羥自由基的清除作用差異顯著（P<0.05）。

2.4 粗多糖對DPPH·的清除作用

經方差分析表明，不同質量濃度粗多糖對DPPH·的清除作用差異極顯著（P<0.01）。由圖7可知，強壯硬毛藻粗多糖對DPPH·有較好的清除作用。強壯硬毛藻粗多糖對DPPH·的清除率隨粗多糖質量濃度的升高而增大，1.0 mg/mL質量濃度的粗多糖對DPPH·的清除率最高，達84.5%;當質量濃度為0.2～0.8 mg/mL時，相同質量濃度的粗多糖和維生素C對DPPH·的清除作用差異極顯著（P<0.01）;當粗多糖、維生素C質量濃度為 1.0 mg/mL 時，清除率間差異顯著（P<0.05）。

3 討論與結論

糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜法試驗結果顯示，強壯硬毛藻粗多糖的組成成分非常簡單，以鼠李糖為主，其中鼠李糖具有提高免疫力、保護肝臟器官、減輕疲勞感等功能[19]。強壯硬毛藻粗多糖中鼠李糖含量較高，預示該粗多糖在藥品、食品、保健品、化妝品等方面具有應用潛能。超氧陰離子是一種活性氧，對機體中的蛋白質、酶和DNA有一定的損害作用，超氧陰離子過多時，會損傷細胞或造成機體衰老、患癌等，而多糖可與超氧陰離子發生氧化反應，清除超氧陰離子，保護機體免受氧化損傷，起到抗氧化的作用[20-22]。研究發現，強壯硬毛藻粗多糖具有一定的去除超氧陰離子的能力，而且高濃度的強壯硬毛藻粗多糖對超氧陰離子的清除作用較強，能夠起到良好的抗氧化作用。當粗多糖質量濃度在0.6～0.8 mg/mL間增加時，粗多糖清除超氧陰離子的能力隨羥基數量的增加而增強，當粗多糖質量濃度較低時，羥基數量減少，而且由于羥基包裹在內部，與超氧陰離子結合的能力較弱，可能導致清除能力較低[23]。當粗多糖的質量濃度達到08 mg/mL時，粗多糖溶液提供的羥基數量迅速增多，使超氧陰離子自由基轉變為穩定的化合物，因此對超氧陰離子的清除率升高。紅藻如江蒿多糖對超氧陰離子的清除率達56.2%，蜈蚣藻多糖對超氧陰離子的清除率也達59.0%[24]。綠藻中南方團山藻多糖對超氧陰離子的清除率最高可達90%以上，石莼可達40%以上[25]。當質量濃度為 0.02 mg/mL 時，7種不同分子量的褐藻巖藻多糖對超氧陰離子的清除率均高于50%[26]，表明強壯硬毛藻與其他綠藻、紅藻和褐藻對超氧陰離子都具有一定的清除能力，可以代替紅藻、褐藻或其他綠藻應用于食品制造工藝等多個領域。

羥自由基是一種活性氧，屬于強氧化劑，可與多種成分發生化學反應，過量的羥自由基會對機體造成一定的氧化損傷[27-28]。與超氧陰離子相比，羥自由基對生物體的毒性更強，危害更大[29-30]。金屬離子可以和硫酸基發生螯合反應，使羥自由基的生成受到抑制[31]。強壯硬毛藻粗多糖中的硫酸基含量較少，與金屬離子的螯合作用較弱，影響了羥自由基的清除作用。當反應達到一定程度時，硫酸基的減少，可能導致羥自由基清除率在粗多糖質量濃度較低時（0.2～0.4 mg/mL）迅速下降。本試驗采用強壯硬毛藻粗多糖為樣品，由于分子量對多糖的生物活性有一定影響，分子量大的多糖的抗氧化活性可能略低于分子量小的多糖[21]，可能導致強壯硬毛藻粗多糖對羥自由基的清除能力較弱，硫酸根含量較低也可能是影響強壯硬毛藻粗多糖對羥自由基的清除能力的原因之一，可見在清除羥自由基方面，強壯硬毛藻粗多糖效果較弱。綠藻中的南方團扇藻和石莼對羥自由基的清除率分別為50%、40%以上[25]。紅藻中的紅蒿對羥自由基表現出了較高的清除能力[24]。褐藻巖藻多糖對羥自由基的清除作用也較強，當清除率達到90%時，其所需多糖的質量濃度相對較低，分子量為64.3 ku的多糖僅需0.89 mg/mL[26]。由此可以看出，強壯硬毛藻與其他綠藻對羥自由基的清除能力相當，且強壯硬毛藻原料來源豐富、易大量繁殖，且價廉，也可以作為其他綠藻、紅藻及褐藻的替代品或在不同領域使用。

DPPH是一種具有單電子、穩定的、以氮為中心的化合物[32]。試驗結果表明，強壯硬毛藻粗多糖對DPPH·的清除效果明顯，清除率較高，抗氧化活性較高。由于多糖濃度升高時，硫酸基、糖醛酸含量增多，多糖的電負性增強，抗氧化活性隨之增強，清除能力也有所提高[21]。綠藻中南方團扇藻、石莼對DPPH·的清除率分別為70%、20%[25]。紅藻江蒿、仙菜對DPPH·也具有一定的清除能力，清除率分別可達57.4%、60%[24]。褐藻泡葉藻多糖對 DPPH· 的清除能力較弱，在質量濃度為0～0.8 mg/mL 的范圍內對DPPH·的清除率均不超過30%。強壯硬毛藻粗多糖在質量濃度為0.6 mg/mL時對DPPH·的清除率已超過30%[33]。以上結果表明，強壯硬毛藻相較于其他綠藻、紅藻及褐藻對DPPH·具有更好的清除能力，可用作食品添加劑或應用到生物制藥等多個領域。

由此可見，強壯硬毛藻粗多糖對羥自由基的清除能力小于對DPPH·和超氧陰離子自由基的清除能力，但仍具有良好的抗氧化活性。過量的自由基對多種生物具有極大的危害，會加速機體老化甚至引起多種嚴重疾病，如腫瘤、癌癥[34]。紅藻多糖的突出抗氧化活性在清除自由基、防止自由基損傷方面具有較好效果[24]，現已被應用于功能性食品添加劑和營養保健品技術等領域。研究證明，馬尾藻、石莼、羊棲菜等海藻多糖已成為涂膜保鮮原材料中的新焦點[35]。褐藻巖藻多糖在食品、保健品和制藥等領域有著廣泛的應用[26]。由上述結果看出，強壯硬毛藻粗多糖與部分紅藻、褐藻和綠藻等都具有相當的抗氧化能力，且強壯硬毛藻也有豐富價廉等優點，因此強壯硬毛藻同樣可以應用于功能性食品添加劑生產、保健品技術、食品涂膜保鮮及制藥等多個領域。

本研究結果表明，強壯硬毛藻粗多糖提取率較高，抗氧化活性較強。因此將強壯硬毛藻粗多糖應用到食品、保健品、化妝品以及生物制藥等領域具有良好的發展前景。

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