廣西豬圓環(huán)病毒2型全基因擴(kuò)增及來源分析

薛新綿

摘要：某豬場發(fā)生疫情，通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測、擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）GX-20全基因序列，通過與國內(nèi)外毒株同源性比對、繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)GX-20與廣東、湖南、貴州和山東等周邊省份同源性較高，且高于歷年分離的廣西流行毒株，結(jié)合引種情況，推測GX-20是由于引種從廣東傳播到廣西。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型;全基因擴(kuò)增;來源

中圖分類號：$852.65⁺1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：2095-9737（2020）06-0008-02

豬圓環(huán)病毒2型（poreine circovirus type 2，PCV2）是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（PCV2-associateddiseases，PCVAD）的主要病原，該病是嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的豬場重要傳染病，每年給我國造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。PCV2是無囊膜的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒，全長約1800bp，包含5個開放閱讀框，編碼Rep、Rep、Cap等蛋白。根據(jù)病毒全基因組和Cap基因，可將PCV2分為8個基因型，其中PCV2a、PCV2b、PCV2d在全球廣泛流行。2010年我國檢出的PCV2變異毒株屬于PCVgd亞型。

作者在發(fā)病豬群中檢出PCV2，通過擴(kuò)增其全基因、與國內(nèi)外毒株進(jìn)行同源性比對，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，推測該病毒來源，為掌握近年來廣西PCV2流行和變異、掌握病毒遺傳進(jìn)化以及致病機(jī)理的研究提供數(shù)據(jù)參考。

1材料和方法

1.1材料

pMD18-T載體、大腸桿菌DH5a、LA TaqMix、LB培養(yǎng)基、DNA抽提試劑盒等試劑分別購自Takara公司、生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2樣品采集、抽提及PCV2全基因擴(kuò)增

發(fā)病豬組織樣品來源于本地某豬場，采集豬肺臟、淋巴結(jié)、脾臟和肝臟。將組織樣品與無菌PBS按照1：4混合、研磨制成勻漿，凍融3次后，離心取上清，用于抽提基因組DNA。以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCV2全基因擴(kuò)增。引物及反應(yīng)條件（表1）、反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)。

1.3DNA片段純化、克隆和測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，參考膠回收試劑盒說明書，回收、純化目的片段，4℃連接pMD-18T過夜，按照文獻(xiàn)介紹的方法，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板，培養(yǎng)過夜后，挑取單個菌落，接種于LB培養(yǎng)基，按照質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒說明書抽提質(zhì)粒，鑒定后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1.4同源性分析及病毒來源

運(yùn)用DNAStar對獲得的PCV2全基因序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)合國外及國內(nèi)各省獲得的PCV2毒株序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，用于分析病毒來源。

2結(jié)果與分析

2.1PCV2全基因擴(kuò)增

利用特異性引物擴(kuò)增出約1767bp基因片段（圖1），與預(yù)期目的基因大小相符。將該毒株命名為GX-20。

2.2PCV2全基因序列測定與分析

GX-20的PCV2全基因擴(kuò)增片段經(jīng)克隆、測序后，獲得全長1767bp序列。利用DNAStar分析其與3株國外PCVl毒株和19株國內(nèi)PCV2毒株的同源性。發(fā)現(xiàn)GX-20與19株國內(nèi)毒株全基因核苷酸序列同源性為95.2%～98.8%，最低的是GXGG毒株，最高的是GD毒株;與7株廣西周邊省份PCV2毒株（GY06、GD-zl、GD、GD-TS、HN07、HN10、AH05）全基因核苷酸序列之間的同源性為96.8%～98.8%，最低的是AH05毒株，最高GD毒株;與10株廣西PCV2毒株（GXGW、GXHK、GXHP、GX、GXWZ、GXLC、GXHZ-1、GXHZ-2、GXGG、GXZZ）之間的同源性為95.2%～98.7%，同源性最低為GXGG毒株，最高為GXHP毒株;與3株國外PCVl毒株之間全基因核苷酸序列的同源性為76.4%～77.O%。

根據(jù)同源性比對，繪制PCV2系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），可見：PCV分成PCV1、PCV2兩大分支，3株P(guān)CVl毒株形成PCV1分支，其他20株P(guān)CV2毒株形成PCV2分支。而PCV2分支又分為兩支，其中GXGG單獨(dú)位于一個分支，其他19株位于另一個分支。本研究的GX-20與3株廣東株（GD、GD-TS、GD-ZJ）、4株廣西株（GXWZ、GXZZ、GXHP、GXGW）、1株湖南株、1株山東株、1株貴陽株親緣關(guān)系較近，其中與GD株親緣關(guān)系最近，與廣西株（GXHZ-1、GXHZ-2、GXGG）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)合發(fā)病豬群是近日從廣東引種來到廣西，因此，推測GX-20隨著引種由廣東傳播到廣西。

3小結(jié)

廣西是我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)大省，PCV2是阻礙廣西養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疫病，每年造成巨大經(jīng)濟(jì)損失;而且PCV2感染可致機(jī)體免疫抑制，降低機(jī)體免疫水平，導(dǎo)致其他病原的繼發(fā)感染，給疫病防控帶來巨大挑戰(zhàn)，因此是養(yǎng)豬業(yè)重點(diǎn)監(jiān)測對象。

近日，從發(fā)病豬群中檢出PCV2病毒，通過全基因擴(kuò)增、克隆、測序、分析等發(fā)現(xiàn)，該毒株與廣東、湖南、貴州、山東等省分離株同緣關(guān)系較近，與廣西分離株同源關(guān)系較遠(yuǎn)，結(jié)合引種，推測該毒株是由廣東傳播到廣西。因此，應(yīng)加強(qiáng)今后引種過程中疫病防控。