轉(zhuǎn)基因技術(shù)和轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)展與應(yīng)用

高晗 鐘蓓

摘要：經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展到今天日趨成熟，轉(zhuǎn)基因動物的制備也涌現(xiàn)出許多的方法。轉(zhuǎn)基因動物制備主要使用的方法有逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、DNA顯微注射法、基因打靶技術(shù)、精子載體法和體細(xì)胞核移植法等，這些方法各自有其優(yōu)缺點。轉(zhuǎn)基因動物如今在生命科學(xué)研究、人類疾病模型、異種器官移植、動物品種改良、食品藥品生產(chǎn)等方面有著重要應(yīng)用，對人類健康和社會發(fā)展有著重大意義，但該項技術(shù)在應(yīng)用過程中仍存在一些問題。動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)和轉(zhuǎn)基因動物制備早已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，隨著理論和技術(shù)不斷向前推進(jìn)，它們必將對人類的疾病治療、生產(chǎn)生活、社會發(fā)展等方面產(chǎn)生巨大的影響。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因技術(shù);轉(zhuǎn)基因動物;基因整合

中圖分類號：Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-9737（2020）06-0001-04

轉(zhuǎn)基因是利用基因工程技術(shù)而整合到動物受體細(xì)胞基因組中的外源基因，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是使用基因工程技術(shù)使外源基因穩(wěn)定整合到動物受體細(xì)胞基因組中，并能夠得到表達(dá)和遺傳的生物技術(shù)，由此得來的動物即為轉(zhuǎn)基因動物。1976年，Jae-nisch把猿猴病毒SV40轉(zhuǎn)人了小鼠囊胚腔中，得到嵌合體小鼠，并通過將逆轉(zhuǎn)錄病毒與小鼠卵裂球共培養(yǎng)使得莫氏白血病病毒基因插入到了小鼠基因組中。1980年，Gorden等通過顯微注射獲得了轉(zhuǎn)入皰疹病毒胸苷激酶基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，證實了顯微注射方法在轉(zhuǎn)基因中的有效性。Palmiter等在1982年將融合大鼠生長激素結(jié)構(gòu)基因的小鼠金屬硫蛋白-I基因啟動子的DNA片段通過顯微注射到小鼠受精卵原核中，得到擁有金屬硫蛋白一生長激素融合基因的快速生長的“超級小鼠”。1985年，Hammer等通過顯微注射法獲得了轉(zhuǎn)基因兔、羊和豬。這幾項研究在轉(zhuǎn)基因動物和轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域具有里程碑的意義，推動了其進(jìn)一步的研究與發(fā)展。

在轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展了幾十年后的今天，研究人員們將這一領(lǐng)域的發(fā)展不斷向前推進(jìn)，目前已出現(xiàn)許多動物轉(zhuǎn)基因的技術(shù)與方法。包括逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、DNA顯微注射法、基因打靶技術(shù)、精子載體法以及體細(xì)胞核移植法等。

1轉(zhuǎn)基因動物的制備方法

轉(zhuǎn)基因動物的制備在技術(shù)上大體包括幾個步驟：①載體的構(gòu)建;②介質(zhì)細(xì)胞的獲得和培養(yǎng);③DNA的導(dǎo)入;④正確重組細(xì)胞克隆的篩選;⑤將介質(zhì)細(xì)胞參與個體發(fā)育，通過受精卵本身發(fā)育，或胚胎干細(xì)胞經(jīng)顯微操作技術(shù)注射進(jìn)囊胚形成嵌合胚胎，或體細(xì)胞經(jīng)顯微操作技術(shù)進(jìn)行核移植形成重構(gòu)胚胎，然后移植進(jìn)代孕動物子宮發(fā)育成個體;⑥個體的交配繁殖與穩(wěn)定。不同方法這些環(huán)節(jié)中可能有不同。

1.1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法

逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，當(dāng)其進(jìn)入細(xì)胞后，會在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，其單鏈RNA可以逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA，然后整合到宿主細(xì)胞的染色體上并長期穩(wěn)定表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)序列（LTRs）具有轉(zhuǎn)錄啟動子的活性，將外源基因連接到LTRs下部，再包裝為病毒顆粒，直接感染受精卵或注射到囊胚腔中，含有外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA就可以被整合到宿主的染色體中。到目前為止，許多研究人員使用這一方法制備轉(zhuǎn)基因動物。1976年，Jaenisch利用逆轉(zhuǎn)錄病毒與小鼠卵裂球共培養(yǎng)將莫氏白血病病毒基因插入到了小鼠基因組中。Robertson等在1986年使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將外源DNA序列引入干細(xì)胞系，實現(xiàn)了生殖細(xì)胞的整合，得到可遺傳的轉(zhuǎn)基因動物。

這種方法的優(yōu)點是：逆轉(zhuǎn)錄病毒能感染分裂細(xì)胞和靜止細(xì)胞，不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng);感染率和整合率高，對技術(shù)要求不高;外源基因多屬單拷貝整合;宿主范圍廣等。但這種方法也有其缺點，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，要求導(dǎo)入的外源基因大小小于10kb;同時逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA可能隨外源基因一起整合到宿主染色體上;干擾外源基因表達(dá);逆轉(zhuǎn)錄病毒本身存在致癌作用，安全性有隱患;外源基因進(jìn)入生殖系統(tǒng)較困難，得到的轉(zhuǎn)基因動物大多為嵌合體。

1.2DNA顯微注射法

顯微注射法是制備轉(zhuǎn)基因動物最早使用的方法，該方法由Gorden等于1980年建立。這種方法利用顯微操作技術(shù)將外源基因片段直接導(dǎo)人原核期胚或培養(yǎng)的細(xì)胞中，而使外源基因整合到宿主的染色體上。研究人員們用此方法成功制備轉(zhuǎn)基因動物。1980年，Gorden等用顯微注射的方法獲得了轉(zhuǎn)入皰疹病毒胸苷激酶基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。1982年P(guān)almiter等通過顯微注射法得到轉(zhuǎn)基因“超級小鼠”。Hammer等在1985年通過顯微注射法獲得了轉(zhuǎn)基因兔、羊和豬。

這種方法的優(yōu)點是：對于外源基因的大小沒有特別限制;整合率較高。但這種方法仍存在缺點，顯微注射技術(shù)存在一定難度;整合位點較隨機(jī)，不利于研究基因的具體結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)調(diào)控。

1.3基因打靶技術(shù)

基因打靶技術(shù)于20世紀(jì)80年代開始發(fā)展，基于胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和基因改造發(fā)展而來。胚胎干細(xì)胞是從胚胎中分離得來的原始的未分化細(xì)胞，具有分化的多潛能性。胚胎干細(xì)胞被注射人囊胚后可以參加受體動物包括生殖腺在內(nèi)的各種組織的嵌合體的形成，在體外改造胚胎干細(xì)胞基因組的過程中，可以使其直接或間接發(fā)育成整個個體。這種技術(shù)基于同源重組的原理，將外源DNA定點整合到靶細(xì)胞的特定基因座上，從而能夠?qū)游锘蚪M進(jìn)行精細(xì)修飾和改造。1981年，Evans和Kaufma等首次成功在體外培養(yǎng)了小鼠胚胎干細(xì)胞，這是基因打靶的技術(shù)基礎(chǔ)。1987年Thompson等首次利用基因打靶技術(shù)對小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行定點誘變，而在隨后的1989年，Mario Capecchi、Martin Evans和OliverSmithies真正意義上獲得了第一例基因敲除小鼠。

這種方法的優(yōu)點是：整合位點專一性較強(qiáng)，能克服隨機(jī)整合的盲目性;表達(dá)水平高;打靶后目的片段可以穩(wěn)定遺傳。但這種方法仍存在缺點，基因打靶的效率太低;產(chǎn)生的串聯(lián)重復(fù)序列穩(wěn)定性低，可能自發(fā)進(jìn)行二次同源重組;某些基因被敲除后，會對動物產(chǎn)生不良影響，甚至致死;敲除的基因功能往往是未知的，要進(jìn)一步考慮基因打靶技術(shù)優(yōu)化;目前一些動物的干細(xì)胞系沒有完全建立好，應(yīng)用受到限制。

1.4精子載體法

精子載體法在轉(zhuǎn)基因過程中利用精子作為外源DNA導(dǎo)人受體細(xì)胞的載體。該方法先將成熟的精子與外源DNA進(jìn)行培養(yǎng)，使精子獲得攜帶外源DNA的能力，將外源DNA帶入卵細(xì)胞中，完成受精，外源DNA整合到染色體中。1971年，Brackett等證明受精時可將外源DNA帶人卵細(xì)胞內(nèi)。1989年，Lavitrano等首次利用小鼠附睪精子與DNA溫育產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。隨后，以精子為載體的動物轉(zhuǎn)基因方面相關(guān)研究陸續(xù)展開。

這種方法的優(yōu)點是：精子與卵細(xì)胞之間的自然融合過程可減少人為機(jī)械操作而給胚胎帶來的損傷;整合率較高。但這種方法仍存在缺點，整合不夠穩(wěn)定;不同體系的研究不夠充分。

1.5體細(xì)胞核移植法

體細(xì)胞核移植法是將外源基因?qū)藙游矬w細(xì)胞而作為核供體，將核移植到去核未受精的成熟卵母細(xì)胞，對其進(jìn)行激活，再將發(fā)育得來的胚胎移人代孕雌性動物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動物制備的方法。1997年Wilmut等婦人利用綿羊的乳腺上皮細(xì)胞作為核供體，首次培育出了克隆綿羊多莉，這是該方法制備轉(zhuǎn)基因動物的代表。1997年7月，英國羅斯林研究所和PPL公司將體外培養(yǎng)的綿羊體細(xì)胞進(jìn)行人凝血因子Ⅸ基因的轉(zhuǎn)染，通過體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆出轉(zhuǎn)基因綿羊波莉。隨后，體細(xì)胞核移植法得來的克隆牛、豬等相繼獲得成功。

這種方法的優(yōu)點是：轉(zhuǎn)基因動物制備效率高;得到的動物個體絕大多數(shù)與供核親本一致，可以保持親本的優(yōu)良性狀。但這種方法仍存在缺點，體細(xì)胞的分化程度高，恢復(fù)全能性困難;這一技術(shù)的過程復(fù)雜，對儀器設(shè)備要求高;細(xì)胞培養(yǎng)的代數(shù)有限;得到的家畜作為食品的安全性問題存在爭議。

2轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)發(fā)展到如今，應(yīng)用方面已深入到生物科學(xué)、構(gòu)建疾病模型、治療疾病、動物生產(chǎn)等許多方面。

2.1生命科學(xué)研究方面的應(yīng)用

實驗室中，轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究提供了合適的研究材料。利用轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)，對研究對象的基因進(jìn)行敲除和過量表達(dá)等，可以研究相關(guān)基因的結(jié)果、表達(dá)、功能和調(diào)控。例如，基因敲除的動物模型對于蛋白質(zhì)生理功能的研究提供了很大的幫助。水通道蛋白家族于1989年被發(fā)現(xiàn)，Verkman、麻彤輝和楊寶學(xué)等學(xué)者利用十幾年的時間構(gòu)建出一系列水通道蛋白基因敲除小鼠，研究水通道蛋白在尿濃縮、消化液、腦脊液代謝等過程中的生理功能。類似的研究還有許多，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)的重要工具。

2.2人類疾病模型方面的應(yīng)用

目前研究人員對許多人類疾病的機(jī)理并不清楚，貿(mào)然在人體上進(jìn)行相關(guān)實驗涉及到安全和倫理等問題。建立相關(guān)人類疾病的動物模型則為這一問題提供了解決方案。利用動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)來構(gòu)建相關(guān)人類疾病的動物模型可以解決自然突變和人工誘變帶來的突變率低以及突變方向難控制的問題。許多研究人員已經(jīng)成功構(gòu)建相關(guān)人類疾病的動物模型。例如，阿爾茲海默癥模型APP/PSI轉(zhuǎn)基因小鼠的建立，這種過量表達(dá)型轉(zhuǎn)基因小鼠如今是世界范圍內(nèi)廣泛使用的評價這一病癥藥物和治療疫苗的動物模型。貧血病轉(zhuǎn)基因小鼠的建立，為研究分析貧血病的發(fā)病機(jī)制、藥物治療效果提供了重要的動物模型。再如，表達(dá)人類原癌基因的轉(zhuǎn)基因兔也已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于人類腫瘤發(fā)生機(jī)制、尋找有效預(yù)防和治療措施的研究。而糖尿病和心血管疾病轉(zhuǎn)基因豬模型也有較多報道。目前，多種疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型已經(jīng)建立，為這類疾病的研究提供了方便。

2.3異種器官移植方面的應(yīng)用

如今有許多疾病涉及到器官衰竭問題，醫(yī)學(xué)工作者們也漸漸采用器官移植作為治療手段，為患者們提供了良好的治療方向。然而器官移植這樣的方法除了對實施手術(shù)的醫(yī)生的醫(yī)術(shù)以及手術(shù)技術(shù)有高要求以外，器官來源的短缺是如今面臨的重要問題。有許多病人在等待器官來源的過程中死亡。在這種情況下，異種器官移植被科學(xué)家們提了出來。應(yīng)用于人體疾病的異種器官移植利用手術(shù)的方法將某種動物的器官或組織移植到人體的某一部位。為了克服人體對異種器官的免疫排斥，科學(xué)家們選擇對動物的器官進(jìn)行人源化修飾和改造，利用轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)培育出基本不使人體發(fā)生免疫排斥的克隆動物。豬的器官大小、結(jié)構(gòu)和功能與人體器官相近，是人體器官移植的最佳材料。雖然目前的研究尚未達(dá)到臨床階段，異種器官移植也面臨著豬內(nèi)源性病毒的對人體產(chǎn)生跨物種感染的風(fēng)險，但利用動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)對異種器官移植繼續(xù)進(jìn)行研究對人類仍具有重大意義。

2.4動物品種改良方面的應(yīng)用

在動物生產(chǎn)方面，生產(chǎn)人員希望許多具有優(yōu)良性狀的動物個體的優(yōu)良性狀能夠得到保留并擴(kuò)大生產(chǎn)，同時希望對一些動物品種進(jìn)行改良。傳統(tǒng)的動物品種改良只能依靠親緣關(guān)系近的物種間的自然突變，而自然突變在自然界中的發(fā)生頻率極低。動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以克服傳統(tǒng)動物品種改良技術(shù)的不足，加快改良進(jìn)程、創(chuàng)造新的突變、打破物種間基因交流的限制。在經(jīng)過動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以對動物進(jìn)行基因改造，以此來將優(yōu)良性狀調(diào)高，提高動物的經(jīng)濟(jì)和營養(yǎng)價值。這些優(yōu)良性狀包括：抵抗疾病和抵抗病原微生物的能力、動物較高的產(chǎn)奶量、高質(zhì)量的肉類、較高的繁殖能力以及動物生長周期的縮短等。目前動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已在這方面取得一些成功應(yīng)用。例如，1998年，美國農(nóng)業(yè)部的研究人員成功獲得了促生長轉(zhuǎn)基因豬（胰島素樣生長因子）。該促生長基因的導(dǎo)人，顯著改變了豬的產(chǎn)肉性能，豬肉脂肪含量減少10%，瘦肉含量增加6%～8%，顯著提高了豬的經(jīng)濟(jì)性能。再如，2008年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所等單位，通過克隆和基因重組技術(shù)，成功制備了轉(zhuǎn)基因豬，該轉(zhuǎn)基因豬與普通豬相比，在肌肉和脂肪中不飽和脂肪酸的含量顯著提高。不飽和脂肪酸為有益人類健康脂肪酸，能使膽固醇酯化，降低血中膽固醇和甘油三酯，降低血液黏稠度，改善血液微循環(huán)，提高腦細(xì)胞的活性，增強(qiáng)記憶力和思維能力。

2.5食品藥品生產(chǎn)方面的應(yīng)用

有研究人員抱希望于通過相關(guān)研究在人類的食品——動植物體內(nèi)含有可治療疾病、強(qiáng)身健體的保健品和藥物等。20世紀(jì)20年代，從豬胰腺中提取的胰島素開始被用作藥物。20世紀(jì)80年代初，人類用重組細(xì)菌制備了胰島素，現(xiàn)在所有糖尿病患者都在使用。其他幾種蛋白質(zhì)，尤其是人類生長激素，也是由細(xì)菌合成的，但細(xì)菌不能合成復(fù)雜的蛋白質(zhì)，如單克隆抗體或凝血因子，這些蛋白質(zhì)必須經(jīng)過翻譯后的修飾（主要包括折疊、分裂、亞單位結(jié)合、y-羧基化和糖基化）才能在體內(nèi)激活或穩(wěn)定。而這些修飾可以發(fā)生在哺乳動物細(xì)胞中。如今通過動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，對動物進(jìn)行基因工程方面的改造，可以使動物生產(chǎn)重組蛋白如包括單克隆抗體、疫苗、血液因子、激素、生長因子、細(xì)胞因子、酶、乳蛋白、膠原蛋白、纖維蛋白原等。如運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以將編碼藥用蛋白的外源基因?qū)氪菩约倚蟮捏w內(nèi)，使其在家畜的乳腺中特異性表達(dá)出相應(yīng)的藥用蛋白，實現(xiàn)動物“生物反應(yīng)器”的功能。

3轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的問題

轉(zhuǎn)基因效率低是動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在面臨的重大問題之一。

在動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的實施過程中，轉(zhuǎn)基因大部分的表達(dá)水平較低，給檢測和轉(zhuǎn)基因動物的制備帶來困難。

利用胚胎干細(xì)胞來進(jìn)行的動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，限制技術(shù)實施的一個重大問題就是胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的難度問題。

轉(zhuǎn)基因動物的制備在許多方面得到應(yīng)用，給人類帶來福音，但其安全性問題也令人擔(dān)憂。轉(zhuǎn)入的基因可能會給動物帶來病毒，轉(zhuǎn)基因動物器官的移植會像人體傳播“人畜共患病”;使用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的食物和藥品可能會給機(jī)體帶來過敏反應(yīng);轉(zhuǎn)基因動物的研究存在相關(guān)倫理問題等。

4展望

動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展到今天，已經(jīng)歷經(jīng)了幾十年的歷史，在這幾十年中，動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)日趨成熟，新的方式方法不斷出現(xiàn)。通過這些方法可人為地改造實驗動物的基因組，為研究其相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)與功能提供了新方法以及新思路。這些方法各具其特點，各有各的優(yōu)點與限制，它們的不斷出現(xiàn)、改進(jìn)以及具備的重大應(yīng)用意義，也使得轉(zhuǎn)基因動物以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為生命科學(xué)研究的重要領(lǐng)域。

目前的發(fā)展趨勢表明，動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)和轉(zhuǎn)基因動物的制備在生物科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)具有較高的研究價值，領(lǐng)域內(nèi)也已經(jīng)掀起了相關(guān)研究的熱潮，這是現(xiàn)在十分具有應(yīng)用價值的研究內(nèi)容之一。

雖然如今轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)還在不斷完善和革新的過程中，許多方面的應(yīng)用尚未進(jìn)入最終的產(chǎn)業(yè)化階段，但隨著理論和技術(shù)不斷向前推進(jìn)，動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)和轉(zhuǎn)基因動物的制備必將對人類的疾病治療、生產(chǎn)生活、社會發(fā)展等方面產(chǎn)生巨大的影響。