西紅花苷對巨噬細胞泡沫化中炎癥和脂質代謝的影響

劉冬冬，屈寶澤，李今朝

（1.錦州醫科大學，遼寧錦州 121000； 2.錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧錦州 121000）

動脈粥樣硬化 （atherosclerosis，AS） 是一種由多因素引起的，以高度特異性的細胞分子反應為特征的慢性炎癥過程，主要累及大、中動脈。其病因尚不清楚，但動脈粥樣硬化的發病機制與炎癥中發生的幾種現象有關，包括巨噬細胞的激活、促炎細胞因子的釋放、生長因子的過度分泌和淋巴細胞的局部活化［1］。盡管動脈粥樣硬化的基礎和臨床研究取得了很大進展，但它仍然是目前最常見的心血管疾病之一，也是世界上導致死亡的主要原因之一［2-3］。炎癥在AS 的發生發展中起著關鍵作用，在動脈粥樣硬化斑塊形成期間，循環的單核細胞進入血管壁的內皮下并轉化為巨噬細胞，隨后吞噬氧化的低密度脂蛋白 （OX-LDL） 后變成泡沫細胞［4］，泡沫細胞是動脈粥樣硬化病變的標志［5］。因此，如何抑制泡沫細胞的形成及以炎癥為研究目標，或成為治療動脈粥樣硬化的關鍵。

西紅花為鳶尾科植物番紅花Crocus sativusL.的干燥柱頭，是自然界存在的唯一水溶性類胡蘿卜素。近年來國內外大量研究表明，西紅花苷在抗心血管系統疾病、抗氧化［6］、抗高血壓、抗動脈粥樣硬化［7］、抗炎［8］、防治糖尿病并發癥等方面有很高的藥用價值。雖然西紅花苷的藥理作用十分廣泛，但是西紅花苷的藥理機制目前研究尚少。本實驗從炎癥的角度出發，探討西紅花苷通過抑制脂質代謝及相關炎癥因子，進而抑制泡沫細胞的形成，發揮抗AS的作用。

1 材料

1.1 細胞 小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7 購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2 試劑與藥物 西紅花苷（批號42553-65-1，純度≥98%） 購自上海源葉生物科技有限公司；氧化性低密度脂蛋白（OX-LDL，批號LW-6002，純度98%，2 mg）、油紅O 染色試劑盒、白介素1β （IL-1β） ELISA 檢測試劑盒、腫瘤壞死因子α （TNF-α） ELISA 檢測試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、MTT 均購自沈陽萬類生物科技有限公司；單核細胞趨化蛋白1 （MCP-1） 檢測試劑盒購自優爾生商貿有限公司；總膽固醇（T-CHO） 試劑盒購自南京建成生物工程研究所；p65、GAPDH 抗體均購自英國Abcam 公司。

1.3 儀器 超速冷凍離心機（H-2050R，湖南長沙湘儀檢測設備有限公司）；CO2培養箱（HF-90，上海力申科學儀器有限公司）；倒置相差顯微鏡（IX-53，日本Olympus 公司）；酶標儀（ELX-800，美國BioTek 公司）。

2 方法

2.1 細胞培養 將小鼠腹腔巨噬細胞RAW 264.7 用含10%胎牛血清的DMEM 培養基于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，當細胞生長至為90% 左右，加入胰酶消化細胞，按1∶2 進行傳代。

2.2 分組及給藥 分為正常組、模型組及西紅花苷低、中、高劑量組。將細胞接種于6 孔板中，待細胞貼壁后，正常組細胞正常培養基培養，模型組組加入50 μg／mL 氧化低密度脂蛋白，西紅花苷低、中、高劑量組加入50 μg／mL的氧化低密度脂蛋白和0.01、0.1、1 μmol／L 西紅花苷，細胞處理12、24、48 h。

2.3 油紅O 染色鑒定泡沫細胞模型 （1） 漂洗，棄上清，用37 ℃PBS 漂洗2 次；（2） 固定，加入4% 多聚甲醛室溫固定20 min；（3） 染色，吸棄多聚甲醛，加入1.5 mL油紅O 染色15 min；（4） 脫色，吸棄染色液，向培養板孔中加入1.5 mL 75% 乙醇，除去多余染色液，再用PBS 漂洗2 次，至沒有可見的紅色物質漂?。唬?） 晾片，用干凈的鑷子取出蓋玻片，置于干凈的臺面上晾干；（6） 封片，用甘油明膠封片；（7） 顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 MTT 法篩選藥物最適時間及濃度梯度 將細胞接種于96 孔板中，5×103／孔，每組設置5 個復孔，待細胞貼壁后依次加入0.01、0.1、1、10、100 μmol／L西紅花苷，放入37 ℃、5% CO2培養箱中處理12、24、48 h。將達到特定時間的各組細胞棄去培養基，更換成0.5 mg／mLMTT 混合液，置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育4 h。4 h 后小心吸去上清，加入150 μL DMSO 以溶解細胞形成的紫色結晶，避光靜置10 min 后在酶標儀上測定其在570 nm 處OD。

2.5 細胞上清液指標檢測 取各組細胞上清，COD-PAP單試劑比色法檢測總膽固醇水平、ELISA 檢測IL-1β、TNF-α、MCP-1 水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.6 Western blot 檢測NF-κB 蛋白表達 采用BCA 法檢測蛋白濃度，用SDS-PAGE 分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF膜，用5% 脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST 漂洗3 次，加入二抗（1∶5 000），室溫下搖床孵育2 h，TBST 漂洗3 次；免疫印跡顯色，Image-J 軟件定量分析蛋白條帶灰度值。

2.7 統計學分析 采用SPSS 19.0 軟件進行分析，計量資料以（） 表示，符合正態分布采用F及q檢驗，不符合正態分布采用秩和檢驗，不同時間點采用重復測量方差分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 細胞圖片及油紅O 染色鑒定 細胞圖片如圖1 所示，染色結果如圖2 所示，細胞內充滿橘紅色脂滴，細胞形態如同指環，說明泡沫細胞造模成功。

3.2 西紅花苷對細胞活性的影響 MTT 法檢測結果顯示，在0.01～100 μmol／L 范圍內，西紅花苷對RAW264.7 細胞的增殖作用逐漸減弱，同一組內隨培養時間的延長細胞活性逐漸增加（圖3）。選取0.01、0.1、1 μmol／L 西紅花苷進行后續實驗。

3.3 西紅花苷對泡沫細胞總膽固醇（T-CHO） 水平的影響 與正常組比較，模型組膽固醇水平增加（P＜0.01）；與模型組比較，西紅花苷高劑量組膽固醇水平下降（P＜0.05）。見表1。

3.4 西紅花苷對泡沫細胞IL-1β、TNF-α、MCP-1 水平的影響 與正常組比較，模型組IL-1β、TNF-α、MCP-1 水平上調（P＜0.01）；與模型組比較，西紅花苷中、高劑量組IL-1β、TNF-α、MCP-1 水平下調（P＜0.05，P＜0.01）。給藥后時間對同一藥物組影響不大，不同時間點所測同一藥物組IL-1β 水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2～4。

圖1 各組細胞形態

圖2 細胞油紅染色（×400）

圖3 0.01～100 μmol／L 西紅花苷對RAW264.7 細胞增殖的影響

表1 不同濃度西紅花苷對T-CHO 水平的影響（mmol／g prot，， n＝3）

表1 不同濃度西紅花苷對T-CHO 水平的影響（mmol／g prot，， n＝3）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05。

表2 不同濃度西紅花苷對IL-1β 水平的影響（pg／mL，， n＝3）

表2 不同濃度西紅花苷對IL-1β 水平的影響（pg／mL，， n＝3）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

表3 不同濃度西紅花苷對TNF-α 水平的影響（pg／mL，， n＝3）

表3 不同濃度西紅花苷對TNF-α 水平的影響（pg／mL，， n＝3）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

表4 不同濃度西紅花苷對MCP-1 水平的影響（pg／mL，， n＝3）

表4 不同濃度西紅花苷對MCP-1 水平的影響（pg／mL，， n＝3）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 西紅花苷對泡沫細胞炎癥通路NF-κB 的影響 與正常組比較，模型組NF-κB 蛋白表達上調（P＜0.01）；與模型組比較，西紅花苷各藥物組NF-κB 蛋白表達降低（P＜0.01），且隨藥物濃度的增加，NF-κB 蛋白表達呈劑量依賴性下降；與西紅花苷低劑量組比較，西紅花苷高劑量組NF-κB 蛋白表達下調（P＜0.05）。見圖4。

4 討論

AS 的發病機制復雜，曾有多種學說從不同的角度闡述，包括脂質代謝紊亂學說、內皮損傷學說、炎癥反應學說、壁面切應力等。近年來“炎癥-反應-損傷”學說得到廣泛的支持，起源于單核細胞或巨噬細胞的多種細胞因子，如異常的炎癥趨化因子、細胞因子等參與動脈粥樣硬化進程［9-10］。NF-κB 是一種關鍵的核轉錄因子，與炎癥反應的調節密切相關［11］。NF-κB 信號通路在AS 的發生發展中起著重要的作用，此信號通路的激活是炎癥反應的核心，泡沫細胞的形成是AS 早期的炎癥細胞。NF-κB 在正常的血管中含有量很少，在AS 中的巨噬細胞和內皮細胞NF-κB 被大量的激活，說明NF-κB 參與了AS 的調控［12-13］。NF-κB信號通路相關信號有TNF-α、IL-1β、MCP-1，這些炎癥因子受NF-κB 的調控，可以影響NF-κB 的活化。

近幾年，中藥抗AS 日漸成為研究的熱點，越來越多的中藥復方和提取物已經被成功運用到AS 和冠心病的治療中［14］，其作用溫和、毒副作用小、不易殘留、免疫藥理調節作用明顯，在預防和治療心血管疾病方面，具有明顯優勢［15-16］。研究發現，西紅花苷在降脂、抗炎、抗AS、抗血小板聚集及心臟保護方面具有顯著的藥理作用。Zheng等［17］研究顯示，高脂飲食喂養的家兔在主動脈中出現嚴重的高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化，同時VCAM-1 的蛋白和mRNA 表達均顯著上調，而給予西紅花苷的家兔可顯著改善動脈粥樣硬化，同時VCAM-1 表達顯著降低。表明西紅花苷具有抗AS 的作用，其機制可能是降低NF-κB 的活性，抑制血管細胞黏附分子-1 （VCAM-1） 表達，從而發揮抗AS 的作用。

圖4 西紅花苷對泡沫細胞炎癥通路NF-кB 的影響

在本研究中，用50 μg／mL 氧化性低密度脂蛋白（OX-LDL）誘導建立泡沫細胞模型。各藥物組中膽固醇的水平均低于模型組，且隨給藥濃度增加膽固醇的水平逐漸降低，表明西紅花苷具有降脂作用。各藥物組中炎癥因子的水平均低于模型組，且隨給藥濃度的增加逐漸降低，表明西紅花苷對炎癥因子IL-1β、TNF-α、MCP-1 有抑制作用。各藥物組中NF-κB 表達均低于模型組，表明西紅花苷可以通過抑制NF-κB 通路活性來發揮抗AS 的作用。

綜上所述，西紅花苷可降低泡沫細胞中膽固醇及相關炎癥因子水平，并且可能通過抑制NF-κB 信號通路來實現的。