山藥商品規格及其質量特性分析

馬 蕊，王露露，陳隨清

（河南中醫藥大學藥學院，河南鄭州 450046）

按質論價是中藥材商品交易的傳統特色，中藥材商品規格等級標準是實現按質論價、優質優價的重要依據［1］。目前在我國現行的《七十六種藥材商品規格標準》 中，山藥的商品規格劃分依據為外觀性狀，但隨著中醫藥現代化的發展，僅依據外觀性狀已無法滿足現實需求，亟需建立能反映中藥材內在質量的商品規格等級標準，這是規范中藥材市場交易的關鍵［2-4］。

山藥為薯蕷科植物薯蕷Dioscorea oppositaThunb.的干燥根莖，其化學成分主要含有蛋白質、多糖、氨基酸、尿囊素等［5-7］，具有補脾養胃、生津益肺、補腎澀精的功效［8］，以及抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血糖等［9-11］作用。趙國華等［12］從山藥塊莖中提取到一種山藥多糖RDPS-I，闡明了其化學結構，并證明其具有免疫調節和抗腫瘤作用。鄭曉珂等［13］采用小鼠子宮增重實驗和人乳腺癌細胞（MCF-7） 增值實驗對尿囊素雌激素樣活性進行篩選，首次發現尿囊素具有雌激素樣作用。陳艷等［14］用氨基酸分析儀測定了山藥中各種氨基酸的組成，結果表明，懷山藥中有17 種氨基酸，其中人體必需氨基酸的含有量占總氨基酸的25.32%。

本研究通過測定浸出物、尿囊素、腺苷、β-谷甾醇、氨基酸、山藥多糖、單糖和寡糖等化學成分的含有量，對山藥不同商品規格等級進行綜合比較分析，為了更好的反映藥材的質量與療效的相關性，對山藥抗氧化和降血糖等生物作用進行評價，以期為制定山藥商品規格等級標準提供理論依據，對規范和保證山藥的質量具有重要意義。

1 材料

1.1 樣品 本實驗采集河北安國、安徽亳州、四川荷花池、廣西玉林、內蒙古赤峰等藥材市場，河南焦作、河北安國等山藥產地，以及焦作地區山藥加工炮制企業的藥材及飲片，共44 批，經河南中醫藥大學陳隨清教授鑒定為薯蕷科植物薯蕷Dioscorea oppositaThunb.的干燥根莖。

山藥在市場上依據加工方式的不同，主要有3 種商品規格，分別為毛山藥、光山藥、山藥片，另有毛山藥、光山藥經炮制而成的飲片。

1.2 儀器 UV-2600 紫外分光光度計、LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津公司）；ME203E 分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；BSA124S-CW 天平（萬分之一，德國賽多利斯公司）；Milli-Q Academic A10 超純水機（美國Millipore 公司）。

1.3 試藥 尿囊素（批號B20909，純度≥98%）、腺苷（批號B21356，純度≥98%）、β-谷甾醇（批號B21972，純度≥98%）、果糖（批號B21896，純度≥99% ）、麥芽糖（批號B20834，純度≥98%）、蔗糖（批號111507-200302，純度≥99%） 對照品均購自上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖 （批號110833-200503，純度≥98%）、麥芽三糖（批號100274-200601，純度100%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH） 購自上海源葉生物科技有限公司；維生素E 軟膠囊購自海南海神同洲制藥有限公司；阿卡波糖購自德國拜耳醫藥保健有限公司；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG） 購自美國Sigma 公司；α-淀粉酶、還原型谷胱甘肽（GSH） 購自北京索萊寶科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 等級劃分 觀察44 批山藥藥材及飲片性狀，然后基于《七十六種藥材商品規格標準》 與市售標示規格等級重新劃分。毛山藥按中部圍粗6、4、2 cm 以上，劃分為一等、二等、三等；光山藥按直徑1.8、1.5、0.8 cm以上，劃分為一等、二等、三等；山藥片按表面白色、黃白色、粉褐色，劃分為一等、二等、三等。最終，得到61 個帶編號樣品。

編碼原則如下，毛山藥MXYYY，其中M 代表毛山藥；X 代表等級編碼，一等1，二等2，三等3；樣品號YYY。光山藥、毛山藥片、光山藥片編號分別為GXYYY、MPXYYY、GPXYYY，等級編碼及樣品號同毛山藥。山藥片PXYYY，其中P 代表山藥片；X 代表等級編碼，白色1，黃白色2，粉褐色3；樣品號YYY。

2.2 水分、總灰分和二氧化硫殘留量檢查 參照2015 年版《中國藥典》 山藥項下測定，發現所有樣品的水分、總灰分均符合規定，但二氧化硫殘留量有8 份超標。

2.3 成分含有量測定

2.3.1 浸出物 參照2015 年版《中國藥典》 山藥項下測定，結果見表1。

2.3.2 尿囊素 參考文獻［15］報道，將流動相調整為甲醇-水（2∶98）；體積流量0.5 mL／min；檢測波長224 nm。色譜圖見圖1。

圖1 尿囊素HPLC 色譜圖

2.3.3 腺苷 參照2015 年版《中國藥典》 中冬蟲夏草腺苷［8］含有量測定方法，將流動相調整為甲醇-水（15∶85）；進樣量20 μL。在此色譜條件下，樣品中腺苷與其他組分獲得了較好的分離，色譜圖見圖2。

2.3.4 β-谷甾醇 參考文獻［16］報道，將流動相改為純甲醇；檢測波長205 nm；柱溫35 ℃。色譜圖見圖3。

2.3.5 山藥多糖 采用文獻［17］報道的紫外分光光度法測定。

2.3.6 單糖、寡糖

圖2 腺苷HPLC 色譜圖

圖3 β-谷甾醇HPLC 色譜圖

2.3.6.1 對照品溶液制備 分別精密稱取果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖對照品10.05、21.21、10.00、12.09、12.35 mg 至2 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，即得（含有量分別為5.025、10.605、5.00、6.045、6.175 g／L）。

2.3.6.2 供試品溶液制備 取山藥粉末約1 g，精密稱定，加15 mL 水煮沸15 min，冷卻至60 ℃以下，加入5 mL 新鮮配制的2%淀粉酶溶液，55 ℃下保溫1 h，不時振搖，加1 滴碘試液，應不顯藍色，若顯藍色則重復上述步驟直至不顯色，冷卻后移入50 mL 量瓶中，加水至刻度，混勻，濾過，續濾液用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.3.6.3 色譜條件 Inertsil NH2色譜柱 （4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-水（80∶20）；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL／min；進樣量20 μL。色譜圖見圖4。

圖4 各成分HPLC 色譜圖

2.3.7 方法學考察 尿囊素、腺苷、β-谷甾醇、山藥多糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖在各自范圍內線性關系良好（r＞0.999 8），加樣回收率試驗中RSD 分別為2.34%、1.38%、1.85%、2.60%、1.70%、1.83%、2.35%、2.37%、2.39%。

2.3.8 樣品含有量測定 將61 批樣品制成供試品溶液，在“2.3.6.3”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表1。

表1 山藥樣品浸出物及各成分含有量測定結果（%）

2.4 氨基酸含有量測定 采用氨基酸自動分析儀，由河南海瑞正檢測有限公司進行測定。

2.5 體外抗氧化活性測定 參考文獻［18］報道，取DPPH約40 mg，精密稱定，溶于無水乙醇中制成20 mmol／mL溶液；取山藥粉末5 g，加10 倍量75% 乙醇超聲提取30 min，濾過，得供試品溶液，75% 乙醇依次稀釋成0.1、1、5、10、20、30 g／L。取DPPH 溶液、供試品溶液各100 μL，充分混勻，室溫下避光放置30 min，在517 nm 波長處測定吸光度Ai；取DPPH 溶液、75% 乙醇各100 μL，測定吸光度Ac；取供試品溶液、75%乙醇各100 μL，測定吸光度Aj，計算DPPH 清除率，公式為清除率＝ ［1-（Ai-Aj） ／Ac］×100%。

2.6 降血糖活性研究

2.6.1 供試品溶液制備 參考文獻［19］報道，取山藥粉末5 g，精密稱定，加入40 mL 乙酸乙酯，超聲30 min 提取2 次，濾過，合并濾液，揮干，殘渣用無水乙醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，依次稀釋成0.5、0.25、0.125、0.08、0.062 5、0.045、0.031 25、0.015 6 g／mL，即得。

2.6.2 α-淀粉酶抑制活性測定 參照Sigma 公司α-淀粉酶操作說明書方法，取待測樣品溶液0.5 mL，加入1%淀粉溶液0.5 mL，25 ℃水浴5 min，然后加入淀粉酶溶液0.5 mL，繼續水浴3 min，加入1 mL DNS 溶液沸水浴中煮沸15 min 終止反應，流水冷卻，加蒸餾水定容至25 mL，540 nm 下測定吸光度，計算酶活性抑制率。以樣品質量濃度為橫坐標（X），酶活性抑制率為縱坐標（Y） 繪制抑制曲線，求出IC50值。

酶活性抑制率＝ ［1-（A1-A2） ／ （A3-A4）］×100%，式中A1為待測溶液吸光度，A2為待測溶液本底吸光度，A3為空白對照溶液吸光度，A4為空白對照溶液本底吸光度。

2.6.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 參照α-葡萄糖苷酶操作說明書方法，在5 mL 67 mmol／mL、pH6.8 磷酸二氫鉀緩沖液中加入0.1 mL 待測樣品、0.1 mL GSH、0.1 mL α-葡萄糖苷酶、，搖勻后37 ℃溫浴10 min，然后加入0.1 mL PNPG，37 ℃水浴反應20 min，加入0.1 mol／mL 碳酸鈉溶液5 mL 終止反應，在400 nm 波長處測定吸光度。按“2.6.2”項下方法計算酶活性抑制率，求出IC50值。

3 數據分析

3.1 成分分析

3.1.1 聚類分析 采用SPSS 20.0 軟件，以浸出物及9 種成分含有量為原始數據，將其標準化處理后進行聚類分析，結果見圖5。

由此可知，相同規格不同等級山藥片單獨聚成一類，其他規格山藥聚成一類，但各規格等級相互交叉較多，可見等級與成分含有量相關性不強，各等級之間無明顯區別。

3.1.2 主成分分析 以浸出物及9 種成分含有量作為變量，特征值和累計貢獻率作為判定依據，SPSS 20.0 軟件對原始數據標準化處理后進行主成分分析。根據降維結果，選出2 個主成分PC1、PC2，特征值分別為8.286、1.054，累積貢獻率達到93.397%，代表性強，浸出物、尿囊素、腺苷、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖在PC1 上具有較高的載荷，說明PC1 主要反映了這些成分的信息。同理，PC2主要反映了β-谷甾醇、多糖、麥芽三糖的信息。

圖5 15 批不同商品規格等級樣品聚類樹狀圖

以每個主成分對應的方差貢獻率占所提取主成分總方差貢獻率之和的比例作為權重，計算主成分綜合得分（F），公式為F＝0.887 1F1＋0.112 8F2，結果見表2。

表2 不同規格等級樣品成分含有量綜合得分

由此可知，山藥片排名第一，其次為毛山藥、毛山藥片、光山藥、光山藥片。但不同規格等級無顯著規律性，表明等級劃分與成分含有量無明顯相關性。

3.1.3 方差分析 聚類分析和主成分分析結果表明，不同規格樣品的等級劃分與成分含有量相關性不強，故不再對其進行方差分析。采用SPSS 20.0 軟件對不同商品規格樣品進行方差分析，多重差異檢驗結果采用字母標記法表示，如在浸出物中山藥片標示a，而其他商品規格不含a，即山藥片與其他商品規格具有顯著性差異；毛山藥與光山藥均含有b，故兩者沒有統計學差異。結果見圖6。

圖6 不同規格樣品中各成分方差分析

由此可知，在浸出物、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖、尿囊素、腺苷含有量方面，山藥片與其他規格樣品均有統計學差異，且含有量最高，其中麥芽三糖最低；在多糖含有量方面，光山藥與其他規格樣品均有統計學差異，含有量最高；在果糖含有量方面，5 種規格樣品均具有統計學差異，其中山藥片含有量最高；在谷甾醇含有量方面，5種規格樣品均無統計學差異。

3.2 統計分析 本實驗共測定了山藥中17 種氨基酸，包括人體必需的7 種，其含有量以谷氨酸、精氨酸、天門冬氨酸最高，胱氨酸最低；必需氨基酸含有量依次為亮氨酸＞苯丙氨酸＞賴氨酸＞纈氨酸＞異亮氨酸＞蘇氨酸＞蛋氨酸。SPSS 20.0 軟件對17 種氨基酸含有量及總量在不同規格樣品之間的差異進行方差分析，結果見表3。

表3 不同規格樣品中氨基酸含有量方差分析（%，， n≥3）

表3 不同規格樣品中氨基酸含有量方差分析（%，， n≥3）

注：在組間多重比較中，小寫字母a～c 表示有顯著差異（P＜0.05），大寫字母A～C 表示有極顯著差異（P＜0.01）。

由此可知，蘇氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、組氨酸含有量在各規格樣品之間無統計學差異；在谷氨酸、絲氨酸、精氨酸、丙氨酸含有量及總量方面，山藥片與其他規格樣品有統計學差異，含有量最高；在纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸含有量方面，毛山藥與其他規格樣品有統計學差異，含有量最高。

3.3 體外抗氧化活性 不同商品規格山藥對DPPH 的清除作用見圖7。由此可知，隨著質量濃度升高，各商品規格山藥的清除作用增強，其中山藥片低于毛山藥、光山藥、毛山藥片和光山藥片。采用Logit 法計算IC50值，并用單因素方差分析比較不同商品規格樣品的清除能力差異，發現山藥片與其他規格樣品有統計學差異，IC50為6.61 g／L，抗氧化活性最弱；毛山藥、光山藥、毛山藥片、光山藥片各等級之間的IC50均無統計學差異，分別為2.24、2.37、1.75、2.04 g／L。

圖7 不同規格樣品對DPPH 的清除作用

3.4 降血糖活性 不同規格樣品對α-淀粉酶的抑制率均小于50%，遠小于陽性對照阿卡波糖，即無明顯抑制作用，與文獻［19-20］報道一致，見圖8。

圖8 不同商品規格樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由此可知，隨著質量濃度升高，各規格樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用增強，其中山藥片高于毛山藥、光山藥、毛山藥片和光山藥片。采用Logit 法計算IC50值，發現各樣品遠大于陽性對照阿卡波糖，其中山藥片抑制作用較強，IC50為0.034 8 g／L；光山藥、光山藥片的最大抑制率均未達到50%，無法計算IC50值；毛山藥、毛山藥片對α-葡萄糖苷酶的抑制作用最弱，IC50分別為0.099、0.103 7 g／L。

4 討論與結論

鮮山藥含水量高，農戶會使用硫磺熏制和熱風干燥的方法加工以達到干燥的效果［21］。由于加工技術水平有限、操作不規范等，有8 份樣品二氧化硫殘留量超標。本實驗以水溶性浸出物含有量為指標對樣品進行測定，結果表明有6 份不合格，推測在產地加工時毛山藥有一個濱水的過程，水溶性成分會有一定流失。

山藥化學成分復雜，以淀粉為主，目前有效成分和指標物質不明確。本研究通過測定浸出物、氨基酸及9 種成分的含有量，發現各規格之間有差異，其中山藥片大部分高于其他規格，但各等級之間無顯著性差異。山藥片降血糖活性強于其他規格，但是抗氧化活性更低；山藥片大部分成分含有量均高于其他規格，與其降血糖活性呈正相關；山藥片中多糖、麥芽三糖含有量較低，文獻報道多糖為山藥主要活性成分，具有較強的抗氧化活性［22］，因此各成分含有量與抗氧化活性呈負相關可能與其含有量有較大聯系。

各規格樣品之間成分含有量差異明顯，可能與加工方式有關。山藥加工成商品需要經過去皮、濱水、晾曬等諸多步驟，而且不同規格加工方式也不一樣。毛山藥、光山藥有時會硫熏，這在一定程度上會影響成分含有量，并且光山藥還要進行搓圓、打光等步驟，更容易流失；山藥片基本上都是直接切片、烘干，可有效保存成分，所以總量較高。

同時，毛山藥、光山藥、毛山藥片、光山藥片抗氧化活性較強，可能是這些樣品在加工過程中經過了硫熏，殘留有亞硫酸基團，它具有清除自由基的能力。但有些毛山藥、光山藥（包括飲片） 并未檢測到二氧化硫殘留，其抗氧化活性也較強，并且其殘留量是否超標與抗氧化活性及多糖含有量均無明顯相關性，具體原因有待進一步研究。