穿龍薯蕷根莖中薯蕷皂苷元的制備

龍香麗 梁清延高 宏Anatoly Politov李彥生陳美玲

（1.大連交通大學材料科學與工程學院，遼寧大連 116028； 2.廣西玉柴機器配件制造有限公司，廣西玉林 537000）

薯蕷科植物在全世界有9 個屬、650 多個品種，其中薯蕷屬就有600 種左右，主要分布在東南亞、南美等熱帶、亞熱帶地區［1-2］。我國薯蕷資源豐富，該屬植物約有50 種，主要分布于陜西、江西、湖北、湖南、四川、云南、貴州、廣州等地［3］，東北地區及內蒙故也有分布，最早記載見于《山海經》，宋代、明代、清代等均有使用記載［4］。其中，穿龍薯蕷Dioscorea nipponicaMakino 對氣候、土壤的要求低，種植廣泛。

穿龍薯蕷根莖中皂苷含有量較高，是生產薯蕷皂苷、皂苷元的主要原材料之一［5］，我國是提供薯蕷皂苷元的最大供應商，每年產量約為5 000 噸［6］。現階段薯蕷皂苷元生產工藝主要是傳統的先水解后提取的Rothrok 法，以及先提取后水解的Marker 法［7-8］，但前者對酸需求量大，污染嚴重，而后者對溶劑需求量大，回收成本高，均存在一定局限性，會破壞環境［9-10］。本實驗采用薯蕷皂苷水分離法，先分離出纖維和淀粉作為附屬資源，并對皂苷漿料進行富集濃縮（實驗室自主研發的工藝，富集率高達98%以上），再經高溫高壓水解制備皂苷元，不僅在分離階段即實現無溶劑提取，附屬資源得以回收，且在水解階段減少酸用量，縮短酸解時間，從而降低制備成本。

1 材料

1.1 藥材 穿龍薯蕷根莖干片由廣東陽江生物科技有限公司提供，經廣東陽江生物科技有限公司郭高工程師鑒定為正品，表皮呈褐色，根須較少。

1.2 試劑與藥物 薯蕷皂苷元對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111539-200001）。乙腈為色譜純（上海阿達瑪斯試劑有限公司）；石油醚（60～90 ℃）、濃硫酸、高氯酸、甲醇、香莢蘭醛等均為分析純；水為蒸餾水和超純水（自制）。

1.3 儀器 FA-JA 型電子天平（上海精科儀器有限公司）；DHG-9040 型真空干燥箱 （上海琦互儀器有限公司）；TGL-10B型離心機（上海安亭科學儀器廠）；DF-101S 型恒溫水浴鍋（鄭州生化儀器有限公司）；JYL-Y925 型破壁機（九陽豆業有限公司）；ZNHW1 000 mL 型恒溫電熱套（上海羌強實業發展有限公司）；S212-2 L 型高壓反應釜（上海森闖儀器有限公司）；UV-9600 型紫外／可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）；LC-20AT 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；索氏提取器。

2 方法

2.1 工藝流程 稱取100 g 穿龍薯蕷根莖干片于燒杯中，加入適量蒸餾水使其在液面以下，浸泡4 h 后取出，置于破壁機中，加入400 mL 蒸餾水，10 000 r／min 打漿，篩網過濾漿液，殘渣用蒸餾水洗滌后再次倒入篩網中過濾，洗滌得到纖維，濾液靜置20 min 后倒出上層液，收集容器底部沉淀，洗滌后得到淀粉。合并洗滌液和倒出的上層液作為懸濁液，對其進行處理，再次分離出部分淀粉，合并、富集懸濁液，得到薯蕷皂苷漿料，將其置于反應釜中進行高溫高壓水解，過濾并洗滌酸解物至中性，加入石油醚，索氏提取器（80 ℃） 提取6 h，結晶，即得薯蕷皂苷元。

2.2 檢測方法

2.2.1 分光光度法 參考文獻［11-12］報道測定纖維、淀粉中薯蕷皂苷元含有量。稱取105 ℃干燥至恒重的薯蕷皂苷元對照品4.3 mg 于25 mL 量瓶中，甲醇定容，作為對照品溶液，精密吸取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mL對照品溶液于10 mL 試管中，80 ℃水浴揮去溶劑，分別加入新配制的0.2 mL 5%香夾蘭醛冰醋酸溶液和0.8 mL 高氯酸，搖勻，置于70 ℃水浴中反應15 min，冰水冷卻后加冰醋酸定容至10 mL，加蓋放置30 min，在457 nm 波長處測定吸光度。以溶液質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A） 進行回歸，得方程為A＝21.022X-0.007 8 （R2＝0.995 4），在1.72～18.92 mg／L 范圍內線性關系良好。將石油醚提取液于70 ℃水浴中揮發至干，甲醇溶解后定容于200 mL 量瓶中，精密吸取0.2 mL 于10 mL 試管中，80 ℃水浴揮去溶劑。加入新配制的0.2 mL 5%香夾蘭醛冰醋酸溶液和0.8 mL 高氯酸，搖勻，置于70 ℃水浴中反應15 min，冰水冷卻后加冰醋酸定容至10 mL，加蓋放置30 min，在457 nm 處測定其吸光度，將其代入回歸方程中得到皂苷元質量濃度，再換算成皂苷元含有量。

2.2.2 HPLC 法 參考文獻［13-14］報道測定皂苷元純度。

2.2.2.1 色譜條件 All-tima C18色譜柱 （150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-水 （90∶10）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長208 nm。

2.2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取薯蕷皂苷元對照品10 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解，即得（每1 mL 含0.4 mg 該成分）。

2.2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取皂苷元5 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解，即得 （每1 mL 含0.2 mg 該成分）。

2.2.2.4 線性關系考察 取對照品溶液0.5、1.25、2.5、3.75、5、6.25 mL，置于10 mL 量瓶中，在“2.2.2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝0.136 6X＋44.658 （r＝0.999 3），在100～2 500 μg／mL 范圍內線性關系良好。

3 結果

3.1 薯蕷皂苷分離

3.1.1 破壁時間對薯蕷皂苷元損失率的影響 圖1 顯示，當破壁時間為20 s 時效果不佳，漿料中殘留有塊狀根莖，過篩時進入纖維中，導致薯蕷皂苷嚴重損失；延長至40 s時薯蕷根莖已基本破壁，薯蕷皂苷元損失率僅為0.08%；繼續延長時，該成分損失率降低程度不明顯，而且纖維分離量不斷減少。因此，確定破壁時間為40 s。

圖1 破壁時間對薯蕷皂苷元損失率的影響

3.1.2 篩網目數對薯蕷皂苷元損失率的影響 圖2 顯示，當篩網目數≥300 目時薯蕷皂苷元損失率增加程度較緩慢；在400 目時該成分損失率迅速增加，達0.44%，其原因是篩網目數過小時部分被纖維包裹的薯蕷皂苷殘留在纖維中而造成損失。考慮到纖維過濾難易程度、濾液中纖維含有量、后期水解時酸用量，確定篩網目數為200 目。

3.1.3 纖維洗滌次數對薯蕷皂苷元損失率的影響 表1 顯示，纖維洗滌6 次后分離得到的纖維量僅有8%，再測定薯蕷皂苷元含有量，結果見圖3。由此可知，隨著纖維洗滌次數增加，纖維中薯蕷皂苷元含有量不斷減少，損失率不斷降低，洗滌3 次時損失率僅為0.06%，繼續洗滌時變化較小。綜合考慮用水量及后續處理量，確定纖維洗滌次數為3 次，纖維量為18%。

圖2 篩網目數對薯蕷皂苷元損失率的影響

表1 纖維洗滌次數對纖維量的影響

3.1.4 淀粉洗滌次數對薯蕷皂苷元損失率的影響 表2 顯示，淀粉洗滌3 次后淀粉量為24%，再測定薯蕷皂苷元含有量，結果見圖4。由此可知，隨著淀粉洗滌次數增加，淀粉中薯蕷皂苷元含有量不斷減少。損失率不斷降低，洗滌3 次時幾乎檢測不到該成分。因此，確定淀粉洗滌次數為3 次，淀粉量為24%。

表2 淀粉洗滌次數對淀粉量的影響

3.2 薯蕷皂苷元制備 將調節好硫酸濃度的薯蕷皂苷漿料從高溫高壓反應釜的進料口傾入釜中，關閉進料閥，并確定其他閥門處于關閉狀態，加壓至2 MPa （經優化得到），打開攪拌開關，設置好水解保溫時間和水解保溫溫度后進行水解。反應結束后，將料液從出料口放出，水解過程可使薯蕷皂苷糖基脫落生成而薯蕷皂苷元。

圖4 淀粉洗滌次數對薯蕷皂苷元含有量及損失率的影響

3.2.1 硫酸濃度對薯蕷皂苷元收率的影響 圖5 顯示，隨著硫酸濃度增加，薯蕷皂苷元收率呈先升后降的趨勢，在1 mol／L 時最高，達 3.04%。因此，確定硫酸濃度為1 mol／L。

圖5 硫酸濃度對薯蕷皂苷元收率的影響

3.2.2 保溫時間對薯蕷皂苷元收率的影響 圖6 顯示，隨著保溫時間延長，薯蕷皂苷元收率呈先升后降的趨勢，在60 min 時水解較充分，但繼續延長后該成分出現分解，導致收率反而下降。因此，確定保溫時間為60 min。

圖6 保溫時間對薯蕷皂苷元收率的影響

3.2.3 保溫溫度對薯蕷皂苷元收率的影響 圖7 顯示，隨著保溫溫度增加，薯蕷皂苷元收率呈先升后降的趨勢，在130 ℃時水解較充分，但繼續升高后該成分出現分解，導致收率反而下降。因此，確定保溫溫度為130 ℃。

圖7 保溫溫度對薯蕷皂苷元收率的影響

3.2.4 正交試驗 在單因素試驗基礎上，選擇保溫時間（A）、硫酸濃度（B）、保溫溫度（C） 作為影響因素，薯蕷皂苷元收率（Y） 作為評價指標，正交試驗優化水解工藝，因素水平見表3，結果見表4。由此可知，各因素影響程度依次為保溫時間＞硫酸濃度＞保溫溫度，最優工藝為A2B2C2，即保溫時間60 min，硫酸濃度1 mol／L，保溫溫度130 ℃。

表3 因素水平

表4 試驗設計與結果

取穿龍薯蕷根莖100 g，浸泡4 h 后取出，置于破壁機中，加入400 mL 水破壁40 s，200 目篩網過濾，纖維、淀粉各洗滌3 次，合并洗滌液、濾液，富集濃縮后得到薯蕷皂苷漿料，用硫酸將其配制成1 mol／L 料液，置于高溫高壓反應釜中，在特定壓力下不斷攪拌，130 ℃下保溫60 min，水解料液過濾、洗滌至中性，105 ℃下干燥后打包，80 ℃下石油醚索氏提取6 h，結晶得到薯蕷皂苷元，進行3 批驗證試驗，結果見表5，可知該成分純度符合行業要求（≥95%）。

表5 驗證試驗結果（， n＝3）

表5 驗證試驗結果（， n＝3）

4 討論與結論

本實驗通過單因素試驗結合正交試驗，得到穿龍薯蕷根莖中薯蕷皂苷元的最優分離工藝為破壁時間40 s，篩網目數200 目，纖維洗滌次數3 次，淀粉洗滌次數3 次；最優水解工藝為保溫時間60 min，硫酸濃度1 mol／L，保溫溫度130 ℃，該成分收率為3.07%，純度為96.25%，符合行業相關要求。

由于國家對環境保護的要求日益嚴格，薯蕷皂苷元產業正面臨著轉型升級，開發綠色節能的制備工藝迫在眉睫。本實驗通過水分離出薯蕷皂苷漿料后再進行高溫高壓水解，不僅可無溶劑提取，附屬資源得以回收，而且能降低后續水解酸用量，縮短保溫時間，節約制備成本。今后，將致力于開發不使用有機溶劑的薯蕷皂苷元綠色分離工藝。