基于網絡藥理學探究藏藥二十五味松石丸治療肝病的機制

史海熠，潘 安，楊欣彤，張 淼，牛 明，顧 健，趙 丹，史志龍*

（1.西南民族大學藥學院，四川成都 610041； 2.解放軍總醫院第五醫學中心全軍中醫藥研究所，北京 100039； 3.昭通市第一人民醫院藥劑科，云南昭通 657000）

藏藥二十五味松石丸是經典藏藥名方，由著名的藏醫名家宦侖扎哪創制，是藏區治療肝膽疾病的最常用的成藥之一。該方劑由松石、珍珠、牛黃、訶子等二十五味藏藥按照藏醫藥理論經復雜炮制加工所得，現收載于《中國藥典》 中［1］，方中木香、丁香行氣止痛，牛黃、藏紅花解毒化濕，訶子、天竺黃、馬兜鈴等有清熱解毒的功能。近年研究表明，二十五味松石丸在治療急、慢性肝損傷，肝纖維化，乙型肝炎等方面均有顯著的療效［2-4］。二十五味松石丸以“涼”性功效藥物為主，可以平衡藏醫理論中“三因”學“赤巴”型的熱性，具有清熱解毒、清肝膽熱病的功效［5］，但目前關于它治療肝病的作用機制方面的文獻報道較少。

藏藥組方復雜，成分多樣，“多成分、多途徑、多靶點”協同作用在復雜疾病的治療上發揮著獨特優勢。但由于其物質基礎和作用機制不明確，并且藏醫理論與現代醫學有明顯區別，給藏醫藥現代研究帶來很大的困難。網絡藥理學作為現代生物醫藥研究領域新興的研究模式，目前已廣泛應用在復方中藥現代化研究中［6-8］。本研究采用該方法分析二十五味松石丸主要活性成分及潛在作用靶點，研究其對疾病網絡的作用機理，進而探討其治療“赤巴”肝病的作用機制及應用規律。

1 方法

1.1 目標化合物篩選 由于二十五味松石丸組方復雜，課題組前期開展了組方規律研究及減方后藥效對比研究，確定了核心配伍組分，結合TCMSP 數據庫，并根據藥材中化合物的專屬性、類藥性（分子量、生物利用率、口服吸收等參數） 及藥理活性的相關報道，確定目標化合物，繪制三維結構文件用于以下研究。

1.2 目標化合物作用靶點預測 將目標化合物的三維結構文件通過Swiss Target Prediction 數據庫 （http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／），應用基于蛋白組學的小分子探針對藥物作用靶點進行蛋白篩選，獲取與選取成分相關的信息。

1.3 靶點蛋白互作網絡構建及功能模塊注釋分析 利用String 數據庫（https：／ ／string-db.org／） 構建靶點蛋白間的相互作用 ［最低互分數 （minimum required interaction score） 為0.4］，生成蛋白之間物理交互和功能相關的互作網絡。按照生物學功能的相關性提取蛋白質密集連接的網絡，建立蛋白質緊密互作的子集，并對模塊調控的相關功能進行描述。

1.4 GO 生物學功能注釋分析 對二十五味松石丸的120個預測靶點進行生物功能分析，收集P＜0.01 者，最小計數為3，富集因子＞1.5 （富集因子是觀測到的計數與隨機期望計數之比），根據其隸屬度相似性將其分組，得到GO、KEGG、Reactome 等通路的分析結果以及PPI 的富集結果。

1.5 二十五味松石丸活性成分-靶點-疾病生物網絡的構建及分析 將二十五味松石丸有效活性成分作用的靶點蛋白通過Disgenet （http：／ ／www.disgenet.org／home／） 上的Summary of Gene-Disease Associations 數據庫對六種常見肝病相關靶點進行映射，篩選治療肝病的靶點。使用Cytoscape 3.7.1 軟件構建成分-靶點蛋白-疾病相互作用網絡模型，進行拓撲學分析，并對主要靶點作通路分析，預測藥物針對肝病的通路和作用機制。

2 結果

2.1 二十五味松石丸主要活性成分篩選 參考課題組前期對二十五味松石丸藥理活性及組方配伍規律的研究結果［5，9-10］，選擇牛黃、訶子、檀香、降香、鴨嘴花、余甘子、木香、綠絨蒿、木香馬兜鈴、船形烏頭、肉豆蔻、丁香、毛訶子、傘梗虎耳草、天竺黃、西紅花、木棉花17 味藥材。

篩選二十五味松石丸主要活性成分時，遵循按單味藥物篩查的方式，優先選取主要活性成分、專屬性成分、與肝病相關的成分，如牛黃中膽汁酸類和膽紅素、毛訶子中沒食子酸等［11-13］。結果，確定40 個目標化合物，見表1。

表1 二十五味松石丸目標化合物

2.2 構建PPI 互作網絡和蛋白質功能模塊注釋分析 為了進一步探討靶點蛋白之間的相互關系，將靶點蛋白導入String 數據庫進行蛋白互作網絡分析（圖1），對調控相似通路的蛋白集群進行ID 著色。結果，靶點蛋白網絡中包含19 個子網絡，分別調控二氧化碳的可逆水合作用，蛋白質自磷酸化等通路。

圖1 PPI 互作網絡

對PPI 互作網絡中聯系緊密的子集進行聚類構建，建立出5 個子網絡（圖2），篩選出3 個可能性最高的生物功能信息作為每個子網絡的功能描述，其生物學功能注釋見表2。5 個靶點蛋白網絡能夠調控PI3K 信號通路，調節有絲分裂細胞周期的G2／M 過程，聚酮化合物代謝過程，葡萄糖代謝過程以及影響G 蛋白偶聯受體。由此可以看出，二十五味松石丸作用靶點存在豐富的內部互作，可通過“多成分多靶點”特點對上述5 個生物功能產生明顯的調控作用，使其臨床應用范圍有了拓展。

2.3 成分-靶點-疾病網絡構建和分析 將化合物結構信息導入Swiss Target Prediction 數據庫（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／） 進行靶點預測，選擇與人類基因結合可能性≥30% 的蛋白作為成分作用靶點，共計120 個。從OMIM、Disgenet 等數據庫中篩選常見肝病（包括肝癌、肝損傷、肝硬化、脂肪肝、肝腫大、乙型肝炎） 的基因、蛋白等靶點，對篩選的藥物作用靶點進行映射。

圖2 生物功能模塊

將藥物、化合物、靶點蛋白和疾病的相關信息導入Cytoscape 軟件構建組分-作用靶點-疾病之間的相互作用網絡圖，見圖3。牛黃、丁香、綠絨蒿、西紅花、余甘子、木棉花、鴨嘴花、訶子、毛訶子九味藥物通過120 個靶點作用于6 種肝病；不同組分可作用于相同的靶點，不同靶點之間又相互協調，共同調控肝病，體現了二十五味松石丸多成分、多靶點的作用特點。其中，對肝癌的作用靶點最多，其次是肝硬化、乙型肝炎，表明二十五味松石丸在治療肝癌方面有著潛在的開發價值。肝硬化是很多慢性肝病發展過程中的階段，存在多種病因［14］，在我國主要是乙型肝炎引起的肝硬化［15］。通過對疾病靶點的篩查發現，二十五味松石丸對肝纖維化和肝損傷的作用靶點較少，與乙型肝炎靶點匹配結果較好，即僅對感染性肝病，尤其是乙型肝炎所引起的肝硬化有治療效果。

表2 功能模塊生物學功能注釋

圖3 組分-靶點-疾病網絡圖

Degree 表示和節點相連的線數目，代表該節點在整個網絡中的重要性，本實驗篩選網絡中Degree ≥Average Degree 的47 個核心節點，包括 AKT1、EGFR、SRC、MMP9、KDR 等（表3）。越來越多的研究表明，許多實體腫瘤中存在EGFR 的高表達［16］，此外MMP-2、MMP-9 這2個靶點還參與肝癌細胞對組織的侵襲轉移過程［17］。

對藥味進行網絡拓撲學分析，發現結合靶點最多的是綠絨蒿、毛訶子、西紅花3 味藥物，見表4～5。課題組對二十五味松石丸配伍特點的前期研究表明，包括綠絨蒿、毛訶子在內的11 種“澀”味藥、以牛黃為首的7 種“苦”味藥、以西紅花為首的3 種“甘”味藥主要用于治療“赤巴”的熱性疾病，起到了清肝、膽熱的功效。在《藏漢合璧常用藏成藥使用手冊》 《新修晶珠本草》 《四部醫典》《藏藥與方劑》 中整理得到的21 種治療肝病的常用藏藥方劑中，使用頻率最高的為西紅花和牛黃［5］，為傳統藏醫理論中的“主”藥，同時其他幾味“仆”藥作用于部分靶點，對二十五味松石丸整體治療各類肝病做出了貢獻［18］。

2.4 基因功能和通路分析 將二十五味松石丸對肝病的120 個潛在作用靶點通過Metascape 網站進行GO 生物功能注釋［19］，篩選P值排名前20 的通路，見圖4、表6。其中，殼聚糖代謝過程（icosanoid metabolic process） 所代表的是任何一組碳二十不飽和脂肪酸中的化學反應和途徑，而PID PTP1B pathway 是參與調控蛋白酪氨酸磷酸酶1B 的通路，該通路可抑制脂肪肝的發生。此外，還包括脂質代謝（metabolism of lipids）、EGFR-TKI 耐藥（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance） 等18 條通路。

表3 關鍵靶點及其拓撲學參數（前10 位）

表4 組分拓撲學參數

表5 疾病拓撲學參數

3 討論

二十五味松石丸為藏醫經典成方，是藏醫治療各類肝病的常用藥物，由于藏醫藥現代研究薄弱，藏醫藥理論與現代醫學有著較大差異，臨床應用范圍不明確，作用機制不清，嚴重阻礙了臨床應用及療效的穩定發揮。本研究采用網絡藥理學方法，探討二十五味松石丸在肝病治療上應用規律及可能的作用機制及藥效物質基礎。研究結果表明，二十五味松石丸中九味成分作用于6 種常見肝病的120 個靶點，可以對肝癌、乙型病毒性肝炎和肝硬化等常見肝病的靶點產生調控作用，明確了二十五味松石丸臨床應用范圍。

圖4 KEGG 通路富集分析

在進一步對潛在作用靶點分析過程中發現，二十五味松石丸部分目標化合物參與殼聚糖代謝過程，促進殼聚糖水解生成WCS 和COS，有報道顯示殼聚糖及其衍生物具有防治藥物性肝損傷的作用［20］。此外，二十五位松石丸調控PID PTP1B 通路從而影響胰島素信號轉導，有研究顯示該通路與脂肪肝的發生有著密切的聯系［21］。另外通路富集分析中發現EGFR 通路為二十五味松石丸關鍵通路，有研究表明EGFR 與腫瘤細胞黏附、增殖、轉移以及腫瘤新血管的生成有關［22］，這顯示出二十五味松石丸具有潛在腫瘤藥物開發價值。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法建立肝病靶點，并構建組分-靶點-疾病作用關系網絡，對二十五味松石丸的作用靶點、通路進行了系統性分析，初步闡釋了該方作用機制，可為其后續研究提供思路。

表6 GO 分析