高效液相色譜-串聯質譜法測定睫毛增長液化妝品中的比馬前列素

2020-08-03 08:57:40彭興盛

分析測試學報 2020年7期

潘晨，許勇，韓晶，彭興盛，鄭榮

(上海市食品藥品檢驗所，國家藥監局化妝品監測評價重點實驗室，上海 201203)

比馬前列素(Bimatoprost)屬于前列腺素類似物(結構式見圖1)，是用于治療青光眼和高眼壓的降眼壓處方藥比馬前列素液滴眼液(商品名Lumigan)的有效成分[1-2]，由美國Allergan公司研制，該公司先后獲準上市了0.03%和0.01%的比馬前列素液滴眼液。臨床試驗發現，比馬前列素具有引起睫毛增長的副作用[3]。于是，Allergan公司于2008年底推出用于治療眼睫毛稀少癥(Eyelash hypotrichosis)[4]的Latisse(含0.03%比馬前列素眼科溶液)，該藥是首個也是唯一一個獲得FDA許可用于睫毛增長、增粗、增黑的藥物，歸入處方藥物管理。目前，Allergan公司擁有比馬前列素藥物用于刺激睫毛生長的全球獨家專利。但比馬前列素除了會刺激睫毛生長外，還會對眼部產生副作用，如刺激皮膚內黑色素細胞的生長，眼周黑色素沉積，眼瞼發癢發腫，眼睛疼痛、結膜充血等，長期過量使用會造成視神經損傷，導致視力下降甚至失明[5-7]。

近年來，某些化妝品廠商為提高市場競爭力，利用比馬前列素刺激睫毛生長的副作用，在睫毛增長液類化妝品中違規添加該成分，使得消費者在獲得睫毛增長效果的同時也飽受其帶來的如眼睛刺激、瘙癢、黑眼圈、結膜充血等傷害。目前，我國《化妝品安全技術規范》(2015年版)[8]的禁限用組分列表中未提及比馬前列素，國外如歐盟化妝品法規(EC)NO 1223/2009[9]附件Ⅱ(禁用物質)和附件Ⅲ(限用物質)中也未作相關規定。但比馬前列素作為藥理活性成分，附帶可預見性的危害，不應添加在化妝品中。值得注意的是，歐盟已重視并在近幾年多次通報并召回含比馬前列素的睫毛增長液，其中也有來自中國的產品，然而我國對于睫毛增長液化妝品中比馬前列素的監管目前仍是空白。因此，為規范化妝品市場秩序，確保化妝品質量安全，保障消費者使用安全，建立睫毛增長液化妝品中比馬前列素含量的檢測方法已迫在眉睫。

圖1 比馬前列素的分子結構式Fig.1 Molecular structure of bimatoprost

目前，比馬前列素的報道主要集中于藥品、生物制品等領域，分析方法主要為高效液相色譜法[10-12]和液相色譜-質譜聯用法[13-14]。化妝品中比馬前列素的檢測方法僅有幾篇外文文獻報道，如Johansson等[15]曾報道了利用液相色譜-四極桿飛行時間質譜(LC-QTOF-MS)和核磁共振(NMR)技術對非藥用產品中未知活性成分的通用篩查方法，其中包含睫毛增長液中前列腺素類似物的篩查，但未作定量分析；Wittenberg等[16]采用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)法測定化妝品中的前列腺素類似物，基于QuEChERS液-液萃取法處理樣品，并采用氘代內標定量，該方法前處理程序相對繁瑣，氘代內標成本高，也較難獲得。為盡快監測國內化妝品市場中比馬前列素的使用情況，本文通過簡單、快速的溶劑提取，建立了一種科學、高效的睫毛生長液中比馬前列素的HPLC-MS/MS測定方法，填補了我國化妝品中比馬前列素測定的空白，為加快化妝品行業的質量監管和補充完善相關檢驗方法提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 UPLC/6495 MS/MS液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀(美國Agilent公司)；Sartorius CP224S和225D-1CN電子天平(德國賽多利斯公司)；5800型超聲儀(美國Branson公司)；MS3渦旋混合器(德國IKA公司)；5810R型臺式離心機(德國Eppendof公司)；Milli-Q Reference A+型超純水儀(美國Millipore公司)。

比馬前列素標準品(純度99%，上海源葉生物科技有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，德國默克公司)；甲酸、乙酸銨(色譜純，德國Sigma公司)。

1.2 標準溶液配制

標準中間溶液：精密稱取比馬前列素標準品10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，搖勻，配成質量濃度為100 μg·mL-1的標準儲備液，于-18 ℃避光保存。精密吸取上述標準儲備液1 mL，用甲醇稀釋定容至100 mL棕色容量瓶中，配成質量濃度為1.0 μg·mL-1的標準中間溶液。

標準工作溶液：精密吸取適量標準中間溶液，用50%(體積分數)甲醇溶液稀釋制得質量濃度分別為0.5、1、5、10、20、50、100 ng·mL-1的系列標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

精確稱取試樣0.2 g(準確至0.001 g)至50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL 50%甲醇溶液渦旋3 min，充分混勻，以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液適量經0.22 μm微孔濾膜過濾后，待測，同步進行空白試驗。

1.4 色譜-質譜條件

色譜條件：色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(4.6 mm×100 mm×2.7 μm)；流動相：5 mmol·L-1乙酸銨(含0.02%甲酸)(A)-乙腈(B)(體積比55∶45)，等度洗脫；柱溫30 ℃；流速0.3 mL·min-1；進樣量5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子電離模式(ESI+)；毛細管電壓：3 500 V；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流速：14 L·min-1；霧化器壓力：1.378 bar；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流速：11 L·min-1；裂解電壓：380 V；檢測方式：多反應監測(MRM)模式。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件優化

考察了水-乙腈、乙酸銨-乙腈、甲酸/乙酸銨-乙腈3種流動相體系對比馬前列素的色譜行為和離子化程度的影響。結果顯示，以水-乙腈為流動相時待測物峰形有拖尾現象，在加入5 mmol·L-1乙酸銨后得以改善。另外，向流動相中添加一定量甲酸可提高比馬前列素的離子化效率，因此實驗考察了水相中添加不同體積分數(0.01%、0.02%、0.05%、0.1%)甲酸對測定的影響。結果顯示，甲酸含量為0.02%時待測物的響應最高。通過優化，最終確定采用含0.02%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨水溶液-乙腈(體積比55∶45)為流動相等度洗脫，此時比馬前列素可在5 min內獲得良好的峰形和響應，其總離子流圖見圖2。

圖2 比馬前列素標準溶液的總離子流圖(50 ng·mL-1)Fig.2 Total ion chromatogram of bimatoprost(50 ng·mL-1)

2.2 質譜條件優化

以1.0 μg·mL-1比馬前列素標準溶液進行質譜條件優化，在正模式下全掃描。結果顯示，[M+H]+峰響應非常低，[M+Na]+豐度最高，為抑制加鈉峰的出現嘗試向流動相中添加一定量乙酸銨，但并無明顯改善[16]。文獻報道對比APCI源和ESI源測定馬前列素的結果，發現APCI源雖可在一定程度上減少[M+Na]+，但整體靈敏度比ESI低[16]。由于[M+Na]+峰容易受分析環境影響而不穩定，在定量分析時應盡量避免使用。另外，進行全掃描時還發現存在豐度較高的[M+H-H2O]+、[M+H-2H2O]+、[M+H-3H2O]+峰，這可能是因為比馬前列素為多羥基化合物，電離時容易脫水得到系列[M+H-nH2O]+峰，因此最終采用響應高且穩定的[M+H-H2O]+(m/z398.2)為母離子，再利用二級質譜掃描確定其子離子，選擇響應好且穩定的2個子離子(m/z362.2、317.1)組建MRM離子對，并優化確定其它質譜參數(表1)。

表1 比馬前列素的質譜參數Table 1 MS parameters of bimatoprost

2.3 前處理條件優化

比馬前列素在甲醇、乙腈等有機溶劑中均具有較好的溶解度，考慮到乙腈毒性大且成本高，故選擇甲醇為的提取劑。由于市售睫毛增長液為水溶液狀態，加入溶劑渦旋即可充分混勻，為簡化操作步驟，比較了不同甲醇含量(100%、80%、50%、30%)超聲(10 min)和渦旋(3 min)的提取效率。結果顯示，以100%甲醇提取時比馬前列素的峰形前展，其余3種比例甲醇提取后的峰形對稱，回收率均高于90%，且以50%甲醇的提取效率最高，故選擇50%甲醇為提取溶劑。通過實驗比較顯示，超聲10 min和渦旋3 min的提取效率無明顯差異，為節約時間成本，故選擇渦旋3 min進行提取。而對一些不能很好分散或溶解的樣品，可進行超聲處理。

由于化妝品基質中含有大量表面活性劑和脂溶性物質，實驗考察了Captiva EMR-Lip脂質凈化柱對樣品的凈化效果。結果發現，在空白基質樣品中添加5.0 μg·g-1比馬前列素，經Captiva EMR-Lip脂質凈化柱重力自洗脫后的回收率低于50%，表明Captiva EMR-Lip凈化柱不適用于目標物凈化，故前處理過程不采用脂質凈化柱凈化。

2.4 基質效應的考察

基質效應會影響方法的準確度和精密度，通常采用提取后添加法評價[17-18]，同時考慮到基質效應的增強或抑制程度一般隨分析物濃度的不同而發生改變，因此本研究采用基質匹配標準曲線的斜率與溶劑配制標準曲線的斜率之比來考察基質效應，若比值小于1，則為基質抑制效應，反之為基質增強效應。結果發現，3個樣品組(質量濃度均為0.5、1.0、5.0、10、20、50 ng·mL-1)的斜率比值為0.92、0.94、0.92，表明該方法存在一定程度的基質抑制效應，采用基質匹配標準曲線定量可較好地消除基質效應的影響，提高結果準確性。

2.5 線性關系、檢出限及定量下限

選用不含比馬前列素的空白樣品，按照“1.3”方法進行樣品前處理，取濾液作為稀釋液，配制比馬前列素質量濃度分別為0.5、1.0、5.0、10、20、50、100 ng·mL-1的系列標準溶液，分別進樣5 μL，以比馬前列素的定量離子對峰面積為縱坐標(y)，對應質量濃度為橫坐標(x，ng·mL-1)進行線性回歸。結果顯示，比馬前列素在0.5～100 ng·mL-1質量濃度范圍內線性良好，線性方程為y=1 706.4x-7.559 6，相關系數(r2)為0.998 2。以3倍信噪比(S/N=3)和S/N=10計算得檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)分別為0.015、0.05 μg·g-1，可滿足分析要求。

2.6 回收率與相對標準偏差

取空白樣品0.2 g，分別加入一定量比馬前列素標準溶液，配成低(0.05 μg·g-1)、中(0.5 μg·g-1)和高(5.0 μg·g-1)3個水平的加標溶液，在優化條件下，每個濃度平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差(RSD)。結果顯示，3個加標濃度下比馬前列素的平均回收率分別為98.6%、101%、99.2%，RSD(n=6)分別為2.4%、2.1%、1.2%，表明該方法的準確度和精密度良好，可滿足檢測要求。