干擾ROCK1 基因對鼻咽癌的細胞侵襲影響分析*

張石芬 陳曦 龔桃根 劉利明

（1 廣東省深圳市人民醫院病理科 深圳518020；2 廣東省婦幼保健院耳鼻喉科 廣州510010；3 廣東省深圳市人民醫院耳鼻喉科 深圳518020）

鼻咽癌屬于惡性上皮細胞腫瘤，多數患者在疾病早期已發生腫瘤侵襲或轉移，故而開展該疾病侵襲相關因子的研究，對疾病治療有重要幫助[1～2]。 本研究選取40 例鼻咽癌患者，采集其癌灶標本及癌旁標本， 探索干擾ROCK1 基因對鼻咽癌的細胞侵襲的影響。 現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016 年4 月～2019 年10 月收治的鼻咽癌患者40 例，其中男26 例，女14 例，年齡28～71 歲，平均（63.24±3.58）歲。 分別采集鼻咽癌標本、癌旁組織各40 份（每位患者采集1 份），由2 位病理科工作人員實施。

1.2 納入標準與排除標準

1.2.1 納入標準 （1）患者均經術后病理檢查確診，且未接受過化療；（2）患者臨床資料完整，患者及家屬同意資料用于臨床分析；（3）患者溝通能力、表達能力正常，具有基本刑事責任能力。

1.2.2 排除標準 （1）合并其他部位惡性腫瘤者；（2）有精神疾病病史者；（3）在參與研究前，接受過化療者。

1.3 研究方法

1.3.1 所用儀器、試劑 二氧化碳培養箱、離心機、低溫冰箱、 電泳儀、 免疫組化檢測工具及試劑盒、ROCK1 抗體及二抗。

1.3.2 檢測分析 對標本實施石蠟包埋后，切片（厚度控制為4 μm），以載玻片放置切片，烘干機上行1 h 烘烤（溫度控制為60℃）；于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中分別浸泡5 min；乙醇梯度水化處理，于蒸餾水中浸泡2 min，以檸檬酸鹽抗原對其修復，置于室溫中，待其冷卻。 對每張玻片滴3%過氧化氫50 μl，室溫下靜置0.5 h，以緩沖液行3 次沖洗，每次沖洗時間控制為5 min。以10%山羊血清50 μl 對各切片封閉處理，室溫中靜置30 min。將ROCK1 抗體滴入各切片，于37℃下靜置2 h，以緩沖液行3 次沖洗，每次沖洗時間為3 min。 將二抗加入， 室溫下反應30 min，以沖洗液沖洗，每次沖洗3 min，共3 次。 將鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶加入其中， 于室溫下靜置30 min。 以緩沖液再次沖洗，每次沖洗3 min，共3 次。 之后以新制二氨基聯苯胺（DAB）顯色液，行3 min 顯色，于顯微鏡下對染色程度觀察，以自來水沖洗，將染色過程終止。 以沖洗液再次沖洗，每次沖洗3 min，共3 次。 以蘇木素行復染處理，在自來水下沖洗，用1%鹽酸對其行分化處理，以自來水對其再次沖洗，共5 min。 梯度脫水后烤干標本，以中性樹膠對其行封片處理后，顯微鏡下觀察。

1.3.3 干擾ROCK1 基因的處理 將鼻咽癌的細胞株（6-10B）放在培養基（RP-MI1640）中培養，培養環境為5%二氧化碳、37℃， 若細胞生長至融合度80%，實施細胞傳代培養，待細胞生長達到對數生長期，用ROCK1 抑制劑對細胞株進行處理（將抑制劑加入培養基即可），設置2 個濃度，分別是10 μM、30 μM。 藥物處理后靜置1 h，對細胞進行收集。 此后，以RIPA 裂解液（含1%苯甲基磺酰胺）對細胞行裂解處理，對總蛋白進行提取。 以BCA 法測定蛋白濃度，制作10% SDS-PAGE 凝膠，加入蛋白，上樣至孔中，垂直電泳，于全濕狀況下，轉PVDF 膜，以牛血清白蛋白封閉處理，將ROCK1 抗體加入，放置在4℃的環境中過夜，孵育。 在第2 天，用緩沖液對其沖洗3次，每次沖洗時間為5 min，之后以HRP 標記二抗行2 h 孵育， 再次用緩沖液沖洗3 次， 每次沖洗時間為5 min，用ECL 發光液對其處理，在暗室中進行曝光。

1.3.4 細胞侵襲處理 于Transwell 小室底部，將ECMatrix 膠鋪好， 將RP-MI1640 培養基加入其中，放置在培養箱內（溫度設置成37℃）。 于小室下室，加RP-MI1640 培養基（含10%胎牛血清），上室加入相同培養基，培養基中不含10%胎牛血清。 將一定細胞懸液加入到各孔，另外設置復孔3 個，培養24 h，染色處理并在室內干燥。將小室放在載玻片上，用顯微鏡觀察，隨機選取5 個視野并照相，對細胞個數進行計算，以侵襲細胞的數量來評估其侵襲能力。

1.4 觀察指標 統計鼻咽癌與癌旁標本ROCK1表達情況， 對以不同方法干擾ROCK1 處理后的ROCK1 表達水平進行測定，測定癌細胞侵襲能力。

1.5 統計學方法 用SPSS20.0 統計學軟件分析數據，計量資料以（±s）表示，采用F檢驗；計數資料以%表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌標本與癌旁標本ROCK1 表達情況分析癌旁組織40 份中，ROCK1 陽性者3 份， 陽性率7.50%； 鼻咽癌組織40 份中，ROCK1 陽性者共19份，陽性率47.50%。 兩組比較差異顯著（χ2＝16.05，P＝0.000）。

2.2 ROCK1 表達情況 對6-10B 細胞株進行干擾ROCK1 處理后實施蛋白質免疫印跡（Western Blot）檢測。 經30 μM 濃度藥物處理的細胞株ROCK1 表達水平明顯低于未經藥物處理的細胞株及經10 μM 濃度藥物處理的細胞株（P＜0.05），經10 μM 濃度藥物處理的細胞株ROCK1 表達水平明顯低于未經藥物處理的細胞株（P＜0.05）。 見表1。

表1 ROCK1 表達情況（±s）

表1 ROCK1 表達情況（±s）

組別 n ROCK1 表達水平未經藥物處理的細胞株經10 μM 濃度藥物處理的細胞株經30 μM 濃度藥物處理的細胞株40 40 40 2.54±0.31 1.28±0.12 0.68±0.14 F P 3.624 0.021

2.3 癌細胞侵襲能力 對6-10B 細胞株進行干擾ROCK1 處理后實施Transwell 小室實驗，在560 nm處記錄數值。 經分析，經30 μM 濃度藥物處理的細胞株癌細胞侵襲能力明顯低于未經藥物處理的細胞株及經10 μM 濃度藥物處理的細胞株（P＜0.05），經10 μM 濃度藥物處理的細胞株癌細胞侵襲能力明顯低于未經藥物處理的細胞株（P＜0.05）。 見表2。

表2 癌細胞侵襲能力（±s）

表2 癌細胞侵襲能力（±s）

組別 n 癌細胞侵襲能力未經藥物處理的細胞株經10 μM 濃度藥物處理的細胞株經30 μM 濃度藥物處理的細胞株40 40 40 F P 172.55±16.34 128.65±15.25 66.31±12.38 5.152 0.018

3 討論

在病理分型方面， 鼻咽癌患者多數為低分化病理類型[3]，經過化療、放療后，仍有20%的患者會出現局部復發[4～5]，提示鼻咽癌細胞侵襲性對該病的復發有重要影響。

ROCK1 蛋白是Rho 相關卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）中的一種，可對細胞黏附、骨架重組發揮調節作用，對細胞遷移及運動造成影響[6～7]。 有研究指出，ROCK1 高表達對腫瘤細胞侵襲能力有重要促進作用，而Rho/ROCK 信號通路，是發生細胞侵襲的重要途徑[8]。ROCK 蛋白和Rho GTP 結合之后，其構象會出現變化，充分暴露其催化結構域，此時ROCK可將下游效應分子激活。

本研究為探索ROCK1 基因在鼻咽癌細胞侵襲中的作用， 選取40 例患者的癌旁組織與鼻咽癌組織， 發現鼻咽癌組織ROCK1 陽性率明顯高于癌旁組織， 可見在癌癥組織中ROCK1 基因呈現出高表達狀態。 對癌癥組織進行處理， 干擾ROCK1 表達后， 結果發現， 經30 μM 濃度、10 μM 濃度干擾ROCK1 處理后，標本ROCK1 表達水平、癌細胞侵襲能力均明顯下降，由此可見，干擾ROCK1 基因能夠對鼻咽癌細胞的侵襲能力造成直接影響。

綜上所述， 干擾ROCK1 基因可降低鼻咽癌的細胞侵襲能力，這可為鼻咽癌的治療提供重要思路，值得后續深入研究。