一例非洲刺猬子宮內增生性病例的組織學診斷

王子煜 焦 哲 張金花 胡薛英 谷長勤

(華中農業大學動物醫學院，武漢，430070)

子宮的增生性病變是人與動物中都較為常見的疾病。目前的組織學分類將子宮增生性病變分為上皮性腫瘤和間質腫瘤以及混合上皮和間質腫瘤[1]。

上皮性腫瘤包括子宮內膜增生、子宮內膜息肉、子宮內膜腺瘤與腺癌。在人類中，子宮內膜增生是一種非常重要的癌前病變。但是在家畜中這種觀點不被認可，因為在家畜中，子宮內膜增生，尤其是囊性子宮內膜增生十分常見[2]。腺瘤非常罕見，它由大量增生的腺體構成，與腺癌、子宮內膜息肉和子宮腺肌癥的病灶非常難以區分[3]。除家兔外，子宮內膜腺癌在家畜中并不多見[4-5]。但人的子宮內膜腺癌卻普遍存在[3]。家畜的子宮內膜腺癌最常發生于年齡大的奶牛。偶爾在雌性的羊(Capra)、馬(Equus)、豬(Sus)、狗(Canis)和貓(Felis)中也有報道[6-12]。子宮內膜息肉常見于犬和貓，是由子宮內膜腺和間質成分的局灶性增生組成，可為單個或多個，通常以有蒂或無蒂的方式向子宮內突出，但是子宮內膜息肉并不被當作任何一種癌前病變[13-14]。在大多數動物生殖道腫瘤中，以平滑肌瘤最為常見。子宮的腫瘤多為間質性腫瘤，其中平滑肌瘤占85%—90%，平滑肌肉瘤占10%，纖維瘤、纖維肉瘤和脂肪瘤則較為罕見[10，15-17]。

本病例記錄了1只來源于非洲刺猬(Atelerixalbiventris)的子宮內多發性的增生性病變，組織學診斷并分析其發病特點，現將組織學診斷結果報告如下，旨為哺乳動物纖維肉瘤的診斷提供新的依據，為哺乳動物子宮增生性病變豐富資料。

1 材料與方法

2018年1月華中農業大學獸醫院送檢1例非洲刺猬子宮角贅生物至病理實驗室進行診斷，該刺猬年齡4歲，雌性。就診時發現其陰道內有血性分泌物，手術摘除卵巢及子宮。

主要試劑：鼠抗人PCK單克隆抗體、鼠抗人α-SMA單克隆抗體，封閉液(30%山羊血清)和顯色液(DAB)購于武漢博士德生物技術有限公司；鼠抗人Ki-67單克隆抗體及配套免疫組化抗原修復緩沖液及HRP標記的羊抗鼠/兔IgG，購于基因科技(上海)股份有限公司。

組織切片的制作：組織經4%多聚甲醛固定，切取多個腫塊，乙醇梯度脫水，常規石蠟包埋，4 μm連續切片，分別進行H.E.染色及免疫組織化學染色。

免疫組化染色步驟：將切好備用的4 μm石蠟切片烤片備用，切片經二甲苯、乙醇梯度脫蠟至水，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，封閉內源性過氧化氫酶，0.01M PBS洗滌2次；將PCK、α-SMA玻片放入枸櫞酸鹽緩沖液中，Ki-67玻片放入稀釋的抗原修復緩沖液中，蒸汽熱修復，在100℃保持30 min，取出自然冷卻；滴加山羊(Caprahircus)血清白蛋白封閉非特異抗原抗體，封閉30 min后甩掉封閉液，滴加配好的一抗(PCK、α-SMA、Ki-67)，以PBS代替一抗作為陰性對照，4℃過夜；次日，PBS洗滌2次后滴加HRP標記的二抗室溫作用30 min；PBS洗滌后DAB顯色，蘇木素襯染，中性樹膠封片。使用Nikon 80i生物光學顯微鏡與圖像采集系統觀察采集圖像并分析。

免疫組化陽性率分析：當陽性染色出現在細胞核中，無論強度大小，均考慮為陽性反應。通過對組織切片的整體觀察進行評估，取陽性較強且均勻的多塊區域拍攝400倍照片，計算所選視野1 000個以上瘤細胞中陽性細胞核的比例。

2 結果

2.1 大體病變

腫塊充滿一側子宮角，子宮角擴張腫脹，內含有大量黑紅色血液(圖1A)。腫塊淡黃色，體積約2 cm×1 cm×1 cm，表面可見豐富的血管，腫塊通過纖細的蒂部與子宮角黏膜相連，連接處的漿膜面可見有一隆起(圖1B)。

圖1 子宮腫塊的大體病變Fig.1 The gross lesion of uterine mass

2.2 組織學觀察

H.E.染色結果顯示腫塊有一層厚厚的包膜，包膜由嗜酸性強，排列密集的梭形細胞構成，該細胞分化良好無明顯異型性，最外層附著有紅細胞。包膜內瘤組織由大量梭形細胞構成，細胞呈旋渦狀、人字形排列，瘤細胞排列較疏松，細胞核大，深染，核仁不明顯。并含有大量的脂肪細胞，膠原纖維的數量在組織內高度可變，瘤組織含有豐富的血管，部分血管壁增厚，并在組織內發現大量肌樣團塊(圖2A，圖2B)。免疫組織化學α-SMA染色發現，包膜由平滑肌細胞構成，且肌樣團塊與增生的血管壁均由平滑肌細胞構成(圖2C)。

圖2 子宮內腫塊的診斷Fig.2 Diagnosis of intrauterine mass

顯微鏡下觀察結果顯示，在漿膜面隆起的部分，腫塊位于子宮角肌層，結構上是一個巨大的空腔，空腔有一腫塊，該空腔的腔壁由柱狀上皮細胞構成，腫塊的最外層同樣由柱狀上皮覆蓋，腫塊內子宮內膜腺大量增生，部分子宮內膜腺出現明顯的囊性擴張。在腫塊內還發現了多個纖維團塊，由旋渦狀排列的成纖維細胞樣細胞與稀疏的膠原纖維構成(圖3A)。免疫組織化學PCK染色示子宮內膜腺上皮陽性(圖3B)。

圖3 子宮壁腫塊的診斷Fig.3 Diagnosis of uterine wall mass

子宮角內腫塊免疫組織化學Ki-67陽性率為33.3%(圖4A)，PCNA陽性率為61.5%(圖4B)，表達量均較高，表示細胞增殖速度較快。

圖4 免疫組織化學Ki-67與PCNA染色Fig.4 Immunohistochemistry Ki-67 and PCNA staining

3 討論

近年來，非洲刺猬逐漸成為一種受歡迎的家庭寵物，子宮腫瘤在這種動物中很常見[2]。

在本病例中，腫瘤本身具有纖維肉瘤常見特征，通過免疫組化對平滑肌肌動蛋白的染色，排除平滑肌肉瘤的干擾即可確診。腫塊邊緣是由一層較厚的平滑肌形成的包膜，并且有平滑肌構成的蒂部與子宮壁相連，可推測腫瘤發生于子宮的肌層。在肌層內，出現了一個子宮內膜間質息肉，與一般的子宮內膜間質息肉不同的是，它沒有向子宮內凸起，而是局限在肌層內。對于刺猬這種動物而言，子宮內同時存在多種成分的增生性病變是常見的，在一項對15只非洲雌性刺猬的子宮增生性病變研究中發現，這些刺猬的發病年齡在3—5歲，所有的病例均伴有陰道出血的癥狀，其中8例是多發性病變，包含多個成分[18]，且在本病例中發病年齡與癥狀也與文獻中一致。

我們發現息肉所在的位置正位于子宮內腫塊蒂部的下方。因此我們推測纖維肉瘤的發生早于息肉，纖維肉瘤膨脹性的生長模式，使得其填滿了整個子宮角，而位于其下方形成的息肉則因無法向子宮內脫出而在肌層局限性地生長。且在息肉的間質內，發現了纖維肉瘤團塊，與子宮內纖維肉瘤結構相同，這也說明了2個增生性的病變起源于同一位置，或是纖維肉瘤向息肉內發生了轉移。

在對纖維肉瘤的診斷中，為了加強其惡性程度的判斷，我們采用免疫組化Ki-67與PCNA的染色進行分析，結果顯示Ki-67與PCNA表達量均較高，說明其惡性程度高。Ki-67是一個重要的細胞增殖標記物，對很多常見的腫瘤疾病的診斷及預測有重要的幫助，目前廣泛地應用于預測各種腫瘤疾病的病情進展[19]，Ki-67表達于所有活躍的細胞周期階段，在細胞核內的定位復雜又有特異性，并隨細胞周期改變而改變[20]。在細胞周期的G1期及S期早期，Ki-67的表達水平較低，在S期及G2期其表達急劇增加，在M期表達水平達到峰值，隨后在細胞分裂后期和末期其表達量迅速下降。Ki-67單克隆抗體標記G1后期S期和G2期M期細胞核抗原，而G0期G1早期的細胞核不被標記，且Ki-67抗原半衰期短，細胞脫離增殖周期后迅速降解這些特點使Ki-67成為優質的細胞增殖標記物[21]。PCNA是真核細胞DNA合成所必需的一種核蛋白，它在G1期PCNA的表達逐漸增加，S期達最高峰，而G2/M期則減少，PCNA的表達可能是DNA多倍體形式表達的一個標記，也成為腫瘤細胞失調狀態下的一個標記[22-23]，檢測PCNA可以客觀評價腫瘤細胞增殖狀態。

在本病例的纖維肉瘤中，我們發現許多肌樣的區域，并且發現了許多血管，這些血管的管壁明顯增厚。通過免疫組化SMA的染色，顯示這些肌樣區域屬于平滑肌，以及血管增厚的管壁同樣屬于平滑肌。這與一種隆突性皮膚纖維肉瘤中的肌樣型非常相似，肌樣型是隆突性皮膚纖維肉瘤的一種亞型[24-27]。但是對于這種肌樣區域的來源卻頗有爭議，有的文獻中認為，肌樣區域來源于腫瘤細胞，是纖維母細胞向肌纖維母細胞分化而形成的，屬于腫瘤的成分[25]。而另外有文獻顯示，肌樣區域來源于血管的平滑肌細胞的增生，因為它們在肌樣區域中發現了狹窄的血管腔隙[26-27]。在國內一篇文獻中對15例肌樣型隆突性皮膚纖維肉瘤進行了研究，該研究發現了肌樣區域形成的過程，由早期的血管平滑肌細胞增生，到肌樣團塊的形成。研究結果也表明了肌樣區域來源于血管的平滑肌細胞[28]。本病例中相同的發現，也說明肌樣型的纖維肉瘤不僅僅出現于人皮膚纖維肉瘤中，在動物的子宮內纖維肉瘤也會出現這種變化。這種變化或許可以成為纖維肉瘤診斷的一個證據。