赤鏈華游蛇形態和血液學參數及各型白細胞百分比的增齡變化

劉溯源 海思嬈 王 鑫 徐文寧 伍 亮 汪 寅 姚 利 張志強

(安徽農業大學動物科技學院，合肥，230036)

選擇適用于脊椎動物研究使用的免疫學參數，是新興學科-免疫生態學(immunological ecology)需要解決的主要問題之一[1-3]。血液成分和血細胞的數量動態與脊椎動物免疫功能的變化有關[4]，盡管這些指標易受外界環境條件及自身身體狀態的影響，但若能在嚴格受控的環境條件下進行實驗，仍不失為比較研究的好方法之一[3-5]。研究表明，變態前后兩棲動物血液中各型白細胞的百分比具有可塑性(plasticity)[5-6]，但對爬行動物免疫功能的發育可塑性，仍所知甚少[7-9]，多集中于成體蛇物種間各型白細胞的百分比和紅細胞大小的比較研究[10-15]。蛇類中，除對陸生的30日齡內的王錦蛇(Elaphecarinata)[7]和50日齡內的滑鼠蛇(Ptyasmucosus)[8]各型白細胞的百分比，以及食物蛋白濃度對王錦蛇生長和血液學參數的影響做過研究外[9]，尚無關于蛇類免疫功能發育生物學方面的研究。

蛇類普遍有耐受極端環境條件的能力，是研究表型可塑性(phenotypic plasticity)理論的理想動物類群之一[16-17]。赤鏈華游蛇(Sinonatrixannularis)又名水赤鏈等，是華東及華南地區稻田、池塘、溪流等水域及其附近常見的一種中型游蛇，白天活動，吃魚，也食蛙類及蝌蚪，卵胎生，懷仔蛇量8—28個，9月前后產仔蛇10條左右(3—14條)[18]。目前，大多數研究與胚胎發育[19]及成蛇的形態、生理等有關[20-22]，對出生后各器官大小和血液學參數的可塑性變化仍未見研究。出殼或產出后1—2個月通常是幼蛇成活的關鍵階段，涉及出生、第一次蛻皮和開口等生活史過程[23]。本研究以室內產出的赤鏈華游蛇幼蛇為研究對象，對出生后3、7—10(第一次蛻皮)、20、30、40和50 d的幼蛇，分別測定了重長比、脾臟濕重指數、血液學參數和各型白細胞百分比的變化，旨在建立出生后特定生活史階段與免疫功能建立的對應關系，豐富爬行動物免疫生態學的基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物來源與分組

試驗用9條懷孕母蛇，于2018年9月購自安徽省池州市貴池區某蛇場，暫養于安徽農業大學動物科技學院動物生理生態學實驗室，每個飼養箱(48.0 cm×30.0 cm×30.0 cm)飼養一條母蛇。9條母蛇共產9窩幼蛇，每窩8—14條，同一窩幼蛇飼養于爬寵用亞克力盒子(26.0 cm×17.5 cm×12.5 cm)，盒內置小木板，供幼蛇上陸棲息，水為曝氣24 h以上的自來水。空調和加熱棒分別控制室溫和水溫，使水溫穩定在(29±1)℃。首次蛻皮后，喂食解凍后剪成小條狀的小塊鯽魚肉，方便幼蛇進食，每2 d喂食一次。在幼蛇出生后3 d、首次蛻皮，以及開口后10、20、30和40 d，每窩隨機取幼蛇1條，每個時間點取幼蛇8條，6個時間點共取樣48條幼蛇，測量體重、體長和尾長后，斷頭處死，采集血液。

1.2 血液學參數的測定

血紅蛋白含量采用改良的沙利氏法通過血紅蛋白計(泰州市姜堰區匯虹實驗儀器廠)測定[24]，即在比色管中先加入400 μL 1.1 mol/L HCl，再加入5 μL血液混勻至呈黃褐色，靜置10 min后，用蒸餾水稀釋，與標準色比色，用標準色的絕對值表示血紅蛋白含量。

紅細胞總數和白細胞總數測定簡述如下[24]：取995 μL的0.9%氯化鈉溶液作為紅細胞稀釋液，加入5 μL血液混勻；另取10 μL血液，加入190 μL的白細胞稀釋液(冰醋酸1.5 mL，1%龍膽紫1 mL，蒸餾水定容至100 mL)，混勻。各取混勻后的紅細胞和白細胞混合液各10 μL，充入血球計數板計數池與蓋玻片的縫隙中，靜置2—3 min后，待細胞下沉后，鏡檢觀察并計數。紅細胞數總數=N×50×106×200=N× 1010，式中N為四角及中間各16個中方格內的紅細胞總數；白細胞數總數=四角各16個中方格內的白細胞總數×10×20×106/4。

1.3 血涂片制作和各型白細胞百分比的測定

移取約20 μL血液，制作2張血涂片。通過南京建成生物工程有限公司生產的快速瑞姬氏染液(產品編號：D010)處理血涂片，參照孫嘉珞等[7]和張志強等[8]描述的操作步驟，用智能血球分類計數器(姜堰市天力醫療器械有限公司，產品編號：TL-2000A)計數每張血涂片中嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞的總數至100個為止，計算各型白細胞占白細胞總數的百分比，以2張血涂片各型白細胞的平均值表示每條幼蛇各型白細胞占白細胞總數的百分比。

1.4 數據處理與統計分析

用SPSS 19.0 for windows進行數據處理和統計分析。用單因素方差分析(one-way ANOVA)及多重比較(multiple comparisons)統計不同發育階段赤鏈華游蛇重長比、脾臟濕重指數、血紅蛋白含量、經常用對數轉換后的紅細胞總數和白細胞總數、各型白細胞的百分比及嗜中性粒細胞與淋巴細胞的比值(ratio of neutrophils to lymphocyte，N/L的比值)的組間差異。文中數據均以平均值±標準誤(mean±SEM)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 50日齡內赤鏈華游蛇重長比和脾臟濕重指數的變化

由表1所示，赤鏈華游蛇的重長比3和7—10日齡組顯著高于30、40和50日齡組(P<0.05)，脾臟濕重指數7—10日齡組顯著高于40和50日齡組(P<0.05)。

2.2 50日齡內赤鏈華游蛇血液學參數的變化

由表1所示，血紅蛋白含量30日齡組與40和50日齡組均無顯著差異，3日齡組最低，30日齡組顯著高于3、7—10和20日齡組(P<0.05)。經常用對數轉換后，紅細胞總數不隨日齡而變化(P>0.05)，白細胞總數20日齡組與30日齡組接近，但顯著高于3、7—10、40和50日齡組(P<0.05)。

2.3 50日齡內赤鏈華游蛇各型白細胞的百分比的變化

由表1所示，淋巴細胞的百分比和嗜堿性粒細胞的百分比占比居于前兩位。淋巴細胞的百分比7—10日齡組顯著高于30日齡組，30日齡組又顯著高于50日齡組(P<0.05)。嗜堿性粒細胞的百分比40日齡組顯著高于7—10和20日齡組(P<0.05)。嗜中性粒細胞的百分比7—10和20日齡組均顯著高于50日齡組(P<0.05)。嗜酸性粒細胞的百分比50日齡組顯著高于3、7—10、20和30日齡組(P<0.05)。單核細胞的百分比50日齡組顯著高于其他日齡組(P<0.05)。N/L的比值無明顯的日齡差異(P>0.05)。

表1 赤鏈華游蛇重長比、脾臟濕重指數、血液學參數和各型白細胞的百分比的變化(平均值±標準誤)Tab.1 Changes of the ratio of body mass to total body length，spleen wet mass index，hematological parameters and different subtypes of leukocyte in Sinonatrix annularis(mean±SEM)

3 討論

3.1 不同發育階段赤鏈華游蛇重長比和脾臟濕重指數的變化

重長比是指示蛇體健康狀態的重要指標[7-9，25]，赤鏈華游蛇開口前主要依賴出生后體內積累的脂肪來保證存活，因此從出生至開口前重長比急速下降，但在開口攝食后趨于穩定的低水平。理論上，主動攝食后，隨著營養水平的提高，重長比應快速上升[25]。例如，滑鼠蛇生后3、7—10、20、30、40和50日齡，重長比3—20日齡增長緩慢，之后陡增，50日齡最高[8]。赤鏈華游蛇雖然終生生長，但50日齡內生長較緩慢，重長比表現出下降趨勢。這可能與兩方面的原因有關：一是本研究投喂的是冰凍后又解凍的鯽魚肉，幼蛇雖有攝食，但并非是其最喜好的食物；二是50 d的處理時間偏短，赤鏈華游蛇對非鮮活食物需要較長時間的適應過程。野外條件下，赤鏈華游蛇主要靠攝食小魚或蝌蚪來補充能量[18]。

變溫脊椎動物中，脾臟濕重指數不受季節[26-27]等環境因素的影響，但在鳥類中可用于指示其機能狀態[28]。赤鏈華游蛇首次蛻皮后的脾臟濕重指數顯著高于40和50日齡組，這與脊椎動物的淋巴器官大小隨年齡增加而趨于萎縮的趨勢一致。

3.2 赤鏈華游蛇血液學參數和各型白細胞的發育可塑性

赤鏈華游蛇血紅蛋白含量30日齡時最高，與40和50日齡組接近，但顯著高于3、7—10和20日齡組，而紅細胞總數未見日齡差異。血紅蛋白是紅細胞的主要成分，由珠蛋白和血色素組成，能與氧結合，運輸氧和二氧化碳，臨床上可作為反映身體貧血程度的一個指標[5]。赤鏈華游蛇首次蛻皮后開始主動攝食，活動加強，隨日齡而增加的血紅蛋白含量有助于滿足日益增加的能量代謝需求、抵御不良環境條件的侵襲。

赤鏈華游蛇的白細胞總數在開口攝食后10和20 d時顯著增加，各型白細胞的百分比隨發育進程動態波動。其中，嗜中性粒細胞和淋巴細胞的百分比均在首次蛻皮和/或開口攝食后增加，而嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和單核細胞的百分比卻降低，N/L的比值未見明顯的日齡差異。研究表明，成蛇血液中各型白細胞的百分比不但具有物種特異性，而且易于受外界環境條件和蛇類自身生理狀態的影響[10-15]。在實驗室內嚴格受控的環境條件下，30日齡內的王錦蛇在出殼后血液中就已存在不同類型的白細胞，20日齡內單核細胞的百分比下降，嗜酸性粒細胞的百分比明顯增加，這可能與開口后的食物刺激有關，也可能與王錦蛇幼蛇喜好彼此撕咬的生物學習性有關[7]；50日齡內的滑鼠蛇淋巴細胞和嗜中性粒細胞的百分比占比居前兩位，但兩者的百分比及N/L的比值均無組間差異；嗜堿性粒細胞的百分比7—10日齡組與3日齡組接近，但7—10日齡組高于其他日齡組[8]。王錦蛇和滑鼠蛇都是適于人工養殖的陸生無毒蛇，兩種蛇也都在出殼后就發育出完善的各型白細胞，這與赤鏈華游蛇相同，提示蛇類在出生前免疫系統可能就已建立[7-8]。此外，與滑鼠蛇相同，赤鏈華游蛇N/L的比值也不隨發育階段而大幅度波動，說明該比值并不能準確反映蛇體的應激狀態[8]。然而，出生后早期階段赤鏈華游蛇、王錦蛇和滑鼠蛇血液中各型白細胞的百分比的變化模式迥異，提示由于生活環境、食性等方面的差異，出生、首次蛻皮和開口時間早晚對多種蛇類的生活史過程可能會有完全不同的影響[7-8]。

4 結論

赤鏈華游蛇重長比和脾臟濕重指數均隨發育進程的推進而下降，白細胞總數、血紅蛋白含量、嗜中性粒細胞和淋巴細胞均在首次蛻皮和/或開口攝食后數量較多，其他類型的白細胞數量較少，但紅細胞總數和N/L的比值無組間差異，說明赤鏈華游蛇在出生后的發育早期就已建立起較為完善的免疫功能，在耗能較多的蛻皮、開口攝食等生活史階段，能通過調整白細胞總數、各型白細胞的比例來適應特定階段的營養和能量需求，促進幼蛇快速生長。