中緬樹鼩尿液成分及性別和親緣關系的影響

侯東敏 賈 婷 章 迪 諶立新 王政昆 朱萬龍，3，4*

(1.云南省高校西南山地生態系統動植物生態適應進化及保護重點實驗室，云南師范大學生命科學學院，昆明，650500；2.云南經濟管理學院，昆明，650106；3.生物能源持續開發利用教育部工程研究中心，昆明，650500；4.云南省生物質能與環境生物技術重點實驗室，昆明，650500)

化學通訊交流在動物的生殖和社會行為中起著重要的作用，包括性吸引[1]、性沖動[2]、領域標記[3]以及個體識別[4]等。隨著現代科學技術的迅猛發展，借助氣相色譜質譜聯用技術對動物化學通訊中尿液、血液或腺體分泌物化學成分的分析已成為研究熱潮[5-6]。

尿液是動物化學通訊中傳遞信息的重要途徑之一。動物尿液中的許多低分子量的化學成分可以通過嗅覺器官被感知，從而引起特定的行為反應[7-8]。嚙齒類動物尿液中含有較多的信息素，如3-乙基-2，7-二甲基辛烷(3-ethyl-2，7-dimethyl octane)是一種雄性小家鼠(Musmusculus)中特有的化學成分，具有釋放信息素的作用，其產生受雄性激素控制[9]；戊醛到癸醛的脂肪族醛作為小鼠氣味成分而被其主要嗅覺器官感知，因此這些成分可能對小鼠同種群個體識別具有重要作用[10]；小鼠尿液中的6-羥基-6-甲基-3-庚酮(6-hydroxy-6-methyl-3-heptanone)是一種獨特成分，它能夠加速雌性小鼠的青春期[11]；小鼠尿液中還含有諸如年齡[12]、健康[13]、繁殖[14]及親屬和個體識別[15]等大量信息。哺乳動物的尿液成分較為復雜，如大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)可以通過尿液進行親緣識別，避免近親交配[16]；獅(Pantheraleo)雄性尿液中2-丁酮(2-butanone)的相對含量顯著高于雌性，而雌性丙酮(acetone)的相對含量顯著于雄性[17]；短尾貓(Lynxrufus)的尿液能夠減少土撥鼠的氣味標記活動，而且能夠減少美洲兔(Lepusamericanus)和黑尾鹿(Odocoileushemionus)的攝食行為[18]。動物尿液中包含許多重要信息，對于其他物種或者同種群個體都是化學感知的豐富來源。

動物常通過將尿液、糞便或腺體分泌物遺留于環境中來進行個體信息的交互響應，但這種社會活動往往受到遺傳和空間距離的影響[19]。通過對小鼠尿液與遺傳相關性的研究表明，小鼠尿液揮發性成分的相對豐度與遺傳相關性程度有關，這一關系可能在該物種的化學信號傳遞和遺傳特性中起到關鍵作用[20]。同樣親緣關系和空間距離對長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)的尿標記行為具有一定影響，這與長爪沙鼠的繁殖或貯食行為相適應[21]。因此尿液揮發性成分可以提供有關遺傳相關性的嗅覺信息，并作為表型匹配的遺傳標識符。

中緬樹鼩(Tupaiabelangeri)屬攀鼩目(Scandentia)，樹鼩科(Tupaiidae)，分布于南亞、東南亞以及中國南部和西南部地區，為東洋界特有的晝行性小型哺乳動物[22]。因其在生物學特征及生理生化等方面與人類較為相近，已被用作非人靈長類動物的替代模型廣泛地應用于生物醫學研究[23]。本研究通過氣相色譜質譜聯用技術對野外親屬中緬樹鼩的尿液化學成分進行測定，旨在探索尿液對野外中緬樹鼩的作用，為揭示中緬樹鼩的通訊機制提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

動物樣本采集于昆明市海口林場，共捕捉成體42只，捕捉后采集動物樣本糞便，低溫保存，溫度為(-20±1)℃。采集動物樣本糞便，提取糞便DNA，選擇高度多態性的微衛星引物擴增并進行測序，所得結果采用Cervus 3.0軟件進行親緣關系模擬鑒定，檢測得到具親緣關系共計16只成年個體(9♀∶7♂)，分為A、B、C、D、E共5組，5組之間的動物個體無親緣關系，組內個體具有親緣關系。所用實驗動物均在昆明市海口林場飼養房內飼養。

1.2 尿液采集

將實驗動物禁食12 h后放入尿液采集籠中，采集籠下端放置漏斗及12 mL樣品瓶(寧波哈邁，HM-1266A)；漏斗內部放置薄脫脂棉以防糞便污染；尿液收集時間為10 min，收集完成后迅速使用封口膜密封瓶口，并置于-20℃密封避光保存。

1.3 尿液樣品前處理

使用固相微萃取法進行尿液樣品吸附處理[24]：(1)萃取頭(50/30 μm DVB/Caron PDMS，Supelco公司，美國)老化：將萃取頭置入氣相色譜進樣口，進樣口溫度250℃，老化30 min。(2)取動物尿液樣品5 mL置于15 mL頂空瓶中，頂空瓶內放置磁子，50 ℃水浴30 min，然后將固相微萃取裝置插入瓶內，吸附萃取40 min，然后將萃取頭置于氣相色譜儀的進樣口進樣。

1.4 氣相色譜質譜聯用技術

尿液化學成分測定采用氣相色譜質譜聯用儀(GCMS-QP2010，島津公司，日本)；色譜柱：INNWAX(30 m×0.32 mm×0.50 μm)；色譜條件：進樣口溫度為250 ℃；載氣：He，純度為99.999%；柱流速：2.54 mL/min；程序升溫：初始40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。質譜條件：離子源溫度220 ℃；傳輸線溫度220 ℃；全掃描方式；掃描范圍：40—500 amu。所得質譜圖利用計算機譜庫NIST(National Institute of Standards and Technology)進行相似度檢索，根據質譜庫中物質的匹配度，再結合物質保留時間和文獻資料[25]來鑒定尿液樣品中的化學成分。

1.5 統計分析

采用Excel 2010和Cervus 3.0進行親緣關系的鑒定，采用Excel 2010進行尿液化學成分的統計分析，采用Origin 8.5軟件制作色譜圖。

2 結果

2.1 野外親屬中緬樹鼩尿液的化學成分

通過對野外親屬中緬樹鼩尿液檢測共得到化學成分450種，其中有效化學成分(≧3個樣本中檢測到某化學成分)145種(表1)，包括醇類46種、酮類30種、烴類21種、醛類15種、酯類8種、酚類7種、吡嗪5種、酸類3種、醚類3種、吡啶1種、腈類1種、芳香烴1種、其他4種。

表1 野外親屬中緬樹鼩尿液化學成分Tab.1 Chemical composition of urine in wild Tupaia belangeri

2.2 野外親屬中緬樹鼩不同性別個體尿液的特有化學成分

野外親屬中緬樹鼩雌雄個體尿液中包含特有的化學成分(表2)。雄性個體中的特有化學成分有5種，分別為苯酚(phenol)、2，2，6-三甲基環庚烷(2，2，6-trimethyl-cyclohexanone)、2-乙基-5-甲基吡嗪(2-ethyl-5-methyl-pyrazine)、3-乙基-2，5-二甲基吡嗪(3-ethyl-2，5-dimethyl-pyrazine)、1，6-二甲基環辛基-1，5-二烯(1，6-dimethyl-1，5-cyclooctadiene)。其中吡嗪2種、烴類、酮類、酚類各1種。尿液化學成分的代表性(C1)色譜圖見圖1。

表2 野外中緬樹鼩雌雄尿液特有化學成分Tab.2 Chemical constituents of male and female urine in wild Tupaia belangeri

圖1 野外親屬中緬樹鼩尿液代表性色譜圖(C1)Fig.1 Representative GC profile of urine in wild Tupaia belangeri(C1)

雌性個體中的特有化學成分有11種，分別為2-甲基-1-辛醇(2-methyl-1-octanol)、反式-3-壬烯-1-醇(E-3-nonen-1-ol)、乙酸橙花叔醇酯(nerolidyl acetate)、戊醇(1-pentanol)、二氫月桂烯醇(dihydromyrcenol)、3，7-二甲基-1-辛醇(3，7-dimethyl-1-octanol)等。其中醇類7種、酯類2種、烴類、酮類各1種。

2.3 野外親屬中緬樹鼩組內單獨缺失和特有化學成分

通過對不同組親屬中緬樹鼩尿液的比較發現，每組均含有單獨缺失的化學成分(表3)。其中A組6種、B組4種、C組2種、D組8種、E組10種。而僅有C組親屬中緬樹鼩的尿液中含有特有的化學成分，即3-庚醇(3-heptanol)，且在C組每個樣本中均檢測到此成分存在。其余各種物質均存在于兩組以上。

表3 野外中緬樹鼩尿液組內單獨缺失和特有化學成分Tab.3 Individual deletions and unique chemical constituents in wild Tupaia belangeri

3 討論

動物識別個體的能力對于維持其穩定的社會群體、親子動態、避免近親繁殖以及調節競爭關系至關重要[26]。本研究檢測得到野外中緬樹鼩尿液有效化學成分145種，遠大于實驗室馴化和繁殖中緬樹鼩的51種[27]。這可能是由于野外食物和棲息地相較于實驗室更為豐富復雜。本研究中野外親屬中緬樹鼩尿液的化學成分種類與實驗室繁殖親屬中緬樹鼩大致相似，但是野外親屬中緬樹鼩尿液的化學成分的數量與實驗室繁殖親屬中緬樹鼩相比較多[24]。這可能是因為野外與實驗室繁殖中緬樹鼩屬于同一物種，因此尿液化學成分種類相似，但由于兩者生存環境和食物資源的不同導致尿液化學成分數量不同。

尿液化學通訊動物個體識別或親緣識別的途徑之一，動物尿液中含有大量可用于化學通訊的微量化學成分[28]。研究表明，狼(Canislupus)尿液中吡嗪類化學成分能夠通過刺激小鼠的副嗅球來誘發其躲避和恐懼僵化行為[29]，其中3-乙基-2，5-二甲基吡嗪(3-ethyl-2，5-dimethyl-pyrazine)、5-乙基-2，3-二甲基吡嗪(5-ethyl-2，3-dimethyl-pyrazine)和2，3-二乙基吡嗪(2，3-diethyl-pyrazine)是誘發小鼠產生恐懼最活躍的化學成分[30]。本研究中，同樣檢測到3-乙基-2，5-二甲基吡嗪(3-ethyl-2，5-dimethyl-pyrazine)和2-乙基-5-甲基吡嗪(2-ethyl-5-methyl-pyrazine)兩種吡嗪類成分，且為雄性個體特有物質，由此推測野外中緬樹鼩能夠通過尿液傳遞信息。

在動物尿液中，有許多化學成分是編碼信息的關鍵組成部分，如丁酸(butyric acid)、2-甲基丁酸(2-methyl butyric acid)和4-庚酮(4-heptanone)等可能影響小鼠的社會等級、個體年齡和繁殖經歷[31]。本研究中也檢測出類似成分，且不同親屬關系的中緬樹鼩檢測出的化學成分存在差異，其中3-庚醇(3-heptanol)僅在一組野外親屬中緬樹鼩中出現且組內樣本均檢測存在。實驗所用野外中緬樹鼩均捕獲自同一地區，食物資源及生存環境極為相似，由此推測導致野外不同親屬關系中緬樹鼩尿液成分不同的原因可能為親屬關系的遠近或者社會等級的分化。而其他組均含有單獨缺失的不同種類的化學成分，由此推測野外中緬樹鼩的親屬信息由多種組分共同編碼，但不同化學成分是否通過其含量變化影響親屬識別還須進一步探索。

綜上所述，食物和棲息地的復雜性影響野外中緬樹鼩尿液化學成分種類；雌雄個體中尿液成分不同，吡嗪類化學成分可能影響其種內爭斗或種間競爭；親屬關系的遠近或者社會等級的分化導致野外不同親屬關系中緬樹鼩尿液成分的不同。野外中緬樹鼩可能通過尿液進行個體識別和親緣識別，這為進一步揭示中緬樹鼩的通訊機制提供了科學理論依據。

續表1

續表1

續表1

續表1