基于線粒體DNA Cyt b西伯利亞狍種群分子系統地理學研究

梁 雪 周紹春 劉艷華*

(1.東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040；2.黑龍江省野生動物研究所，哈爾濱，150081)

鹿科(Cervidae)動物廣泛分布于整個歐亞大陸，包括40種鹿[1]。狍(Capreolus)是鹿科中分布最廣泛的哺乳動物之一，其中包括體形較小的歐洲狍(Capreoluscapreolus)和體形較大的西伯利亞狍(Capreoluspygargus)。這兩種狍的區別主要表現在形態和基因上的差異。西伯利亞狍分布范圍從伏爾加河右岸延伸到俄羅斯遠東地區，包括哈薩克斯坦、天山、阿拉泰、蒙古、中國的華北和華中地區。盡管對亞種的分類仍有爭議，但學者普遍認為西伯利亞狍至少由3個亞種組成，即C.pygarguspygargus(從伏爾加河到貝加爾湖和俄羅斯東北部)、C.pygargustianschanicus(或C.c.bedfordi)(天山、蒙古、俄羅斯遠東和韓國)和C.pygargusmelanotis(西藏東部、甘肅、四川、中國)。

與歐洲狍相比西伯利亞狍在分子系統地理學上的研究較少。Randi等[2]的研究認為，西伯利亞狍可分為兩大集群，即俄羅斯遠東阿穆爾地區的東部集群和西伯利亞西部庫爾干地區的西部集群。基于RAPD標記(random amlified polymorhic DNA)，Petrosyan等[3]的研究結果證實了將西部和東部群體分別劃分為C.pygarguspygargus和C.pygargustianschanicus的科學性。另一方面，根據與其他亞種的形態差異，Xiao等[4]的研究認為在中國東北發現的西伯利亞狍屬于C.pygargusmanchuricus亞種。Lorenzini等[5]的系統發育分析研究結果表明西伯利亞狍的3個單倍群分布在該物種整個分布范圍內，即俄羅斯西部和東部、吉爾吉斯斯坦、中國東北和華北，但沒有明顯的地理結構。此外，部分學者[6-7]的研究還發現韓國濟州島的狍與其他種群存在遺傳差異，并將韓國濟州島分布的孤立種群命名為第四亞種C.pygargusochracea。

系統地理學以系統發育及地理分布結構為基礎開展研究，且將以線粒體基因為基礎的系統發育等方法應用于各個生物類群研究。線粒體DNA是一種共價閉合環狀的雙鏈DNA分子，具有遵循母系遺傳、進化速率快、遺傳上相對獨立、無組織特異性等優點，在物種系統發育，種內遺傳分化等方面具有廣泛的應用價值[8-9]。最常用的線粒體DNA標記基因是Cytb基因，因為Cytb是線粒體基因中結構和功能最為清楚的基因之一[10]，該基因進化速度適中，對種群間、種間、屬間甚至科間的系統發育研究均適用[11]。因此本研究以Cytb基因為標記方式，對西伯利亞狍分子系統地理學進行探索性研究以期為西伯利亞狍的分子系統地理學研究補充數據。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和DNA擴增

本研究樣品采自小興安嶺地區，通過足跡跟蹤收集新鮮狍糞便40份。樣品采集時，將每份樣品進行封裝，封裝后的樣品低溫保存，直至運到實驗室放進-20 ℃以下冰箱內。

使用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取糞便DNA，采用引物L14724[12]：5′ CGA GAT CTGAAAAAC CAT CGT TG 3′ 和H15149[13]：5′ AAA CTG CAG CCC CTC AGA ATG ATA TTT GTC CTC A 3′擴增Cytb序列。PCR反應體系為：2 μLDNA、6 μL dNTPs、0.9 μLF引物、0.9 μLR引物、0.6 μLTaqTMDNA聚合酶、15 μL 1 × PCR buffer、4.6 μL H2O。PCR反應體系在94 ℃預變性2 min，然后進入如下循環：98 ℃ 變性10 s，59 ℃退火30 s，68℃延伸30 s，共35個循環，最后68 ℃延伸10 min，4℃保存。PCR 產物采用 1.0%的常規瓊脂糖凝膠電泳檢測，上樣量為 5 μL PCR 產物加1 μL 6×loading buffer，120V 電壓電泳 30 min，Good wall 染色，凝膠成像系統觀察電泳譜帶，并將電泳條帶較亮較窄的擴增產物送至哈爾濱擎科生物科技有限公司進行純化并測序。

1.2 數據分析

將所測的序列結果應用Clustal X 2.0軟件進行DNA序列排列，并輔以人工校對[14]。通過BLAST搜索[15]，與已知的西伯利亞狍線粒體同源序列比對，確定是否為目的序列。應用DnaSP 4.0軟件[16]確定單倍型。應用MEGA 7軟件[17]，采用最大似然法、鄰接法和最大簡約法進行構建系統發育樹，通過自引導檢驗(bootstrap)獲得系統分支的置信度(重復次數為1 000)。應用PopART 1.7軟件[18]，基于TCS Network分析單倍型之間的系統發育關系。

2 結果

從獲得的40份糞便樣品中成功擴增出32個序列，序列長度為403 bp，獲得9個單倍型，單倍型多樣性(h)為(0.813±0.045)，核苷酸多樣性(Pi)為(0.004 74±0.000 71)，平均核苷酸變異數(K)為1.911。從GenBank上下載40條序列(表1)，獲得23個單倍型。以馬鹿(Cervuselaphus)(登錄號：GU457434)為外群構建系統發育樹。3種不同的系統發育樹具有基本相同的拓撲結構，最清晰全面的拓撲結構是由鄰接法生成的(圖1)。

圖1 基于NJ法構建的西伯利亞狍mtDNA Cyt b基因的系統發育樹，以馬鹿為同源序列的外群，節點處的數字為Bootstrap重復百分比，重復次數為1 000Fig.1 Phylogenetic tree of mtDNA Cyt b gene of Capreolus pygargus constructed based on NJ method.Red deer(Cervus elaphus)was the outgroup of homologous sequence.The number at the node is the percentage of bootstrap repeats with 1 000 repetitions

表1 GenBank下載序列信息Tab.1 GenBank download sequence information

系統發育樹主要由4個單倍群組成，分別命名為A、B、C、D。其中A由俄羅斯遠東地區(Khabarovsk、Yakutia)和韓國濟州島的單倍型組成。B由哈薩克斯坦、俄羅斯西伯利亞地區(Sverdlovsk、Irkutsk)和波蘭等地區的單倍型組成。C由中國東北地區的單倍型組成。D由蒙古地區的單倍型組成。A和B與C、D是并行的姐妹枝。A、B、C基本符合西伯利亞狍亞種分類：C.pygarguspygargus、C.pygargustianschanicus(或C.c.bedfordi)和C.pygargusmelanotis。由西伯利亞狍的單倍型網絡分析圖(圖2)可以看出，西伯利亞狍明顯由四簇單倍群組成，其結果與系統發育樹一致。

圖2 基于TCS Network構建的西伯利亞狍mtDNA Cyt b基因單倍型網絡分析Fig.2 Haplotype Network analysis of mtDNA Cyt b gene of Capreolus pygargus constructed based on TCS Network

3 討論

本研究分析了中國小興安嶺地區40份野生西伯利亞狍樣品的線粒體DNA Cytb基因的部分序列，并與GenBank 中其他地區西伯利亞狍的序列進行分析研究，系統發育分析與單倍型網絡分析結果表明西伯利亞狍由4個單倍群組成，有較清晰的系統發育關系和地理模式，這與其他學者研究結果相吻合。部分學者[2，19-20]使用mtDNA序列的研究結果表明西伯利亞狍可以分為兩個具有地理模式的主要集群，即西伯利亞東部集群和西伯利亞西部集群，且符合西伯利亞狍亞種C.pygarguspygargus和C.pygargustianschanicus的分布范圍。另外，Lee[21]使用微衛星標記的研究結果表明，基于Nei’s DA距離建立的UPGMA樹具有3簇拓撲結構，結果表明，韓國大陸、蒙古、西伯利亞東部的種群聚為一枝，西伯利亞中部的種群聚為一枝，韓國濟州島的種群單獨聚為一枝。

相反，在部分學者的系統地理學研究中認為西伯利亞狍沒有明顯的地理模式[5，22-23]。Lorenzini等[5]通過貝葉斯分析獲得的系統發育樹包括3個主要單倍群：單倍群A由俄羅斯西部、吉爾吉斯斯坦、波蘭、立陶宛和中國華北等地區的單倍型組成；單倍群B由俄羅斯東部和中國東北地區的單倍型組成；單倍群C由俄羅斯東部、中國東北和華北地區的單倍型組成，遺傳譜系和地理分布之間無法建立任何關系。實際上，在西伯利亞、吉爾吉斯坦和俄羅斯遠東人口稀少的地區，沒有任何自然或人為的屏障來阻止不同種群的西伯利亞狍的混合。Vorobieva等[23]的研究表明，在西伯利亞狍亞種的假定分布范圍內，沒有發現任何與亞種分布范圍一致的單倍群。

在系統發育和單倍型網絡分析中發現單倍群B包含假定于歐洲狍分布范圍內的單倍型，即波蘭地區的單倍型。目前，在伏爾加河和唐河之間的區域被認為是歐洲狍和西伯利亞狍的雜交區域。這兩個物種的大部分進化史可能都生活在不同區域中。在史前時期，由于它們重疊區域的交替收縮和擴張，兩個物種種群的混合肯定不止一次[24]。因此可能是由于種群擴張過程中高度分化譜系之間的雜交而引起的一個古老基因的滲入[5]。此外，韓國濟州島和俄羅斯遠東地區的單倍型組成單倍群A，但在其他學者的研究中，韓國濟州島的西伯利亞狍為一個孤立種群，與其他所有的西伯利亞狍(包括韓國大陸的種群)在基因上存在分歧[21]。有學者對韓國濟州島的西伯利亞狍提出了第四亞種命名C.p.ochracea[7]。由于本研究僅采用mtDNA一種遺傳標記方式，具有其母系遺傳的局限性，對于韓國濟州島的西伯利亞狍還需基于更多的遺傳標記方式開展進一步的研究。

本研究表明，至少有4個不同的遺傳譜系可能存在于西伯利亞狍的種群：俄羅斯遠東地區和韓國濟州島，俄羅斯西伯利亞地區、哈薩克斯坦和波蘭，中國，蒙古。諸如西伯利亞狍之類的食草動物在生態系統中起著重要作用，為大型食肉動物提供了獵物。因此對西伯利亞狍種群進行適當的遺傳管理，開展遺傳狀況持續監測研究，這對于維持生態系統健康發展至關重要。