豬腸外致病性大腸埃希菌的分離鑒定及部分生物學特性研究

李承浩 秦樹英 曾文婷 李觀靜 呂海莉 謝江 吳健敏*

（1. 廣西壯族自治區獸醫研究所 廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530001；2. 廣西農業職業技術學院，廣西 南寧 530006）

大腸埃希菌屬于革蘭陰性細菌，有數根鞭毛，沒有芽胞，是埃希氏菌屬代表菌，也叫大腸桿菌。大腸埃希菌廣泛存在于自然環境中，同時也是條件致病菌[1]，某些致病性強的菌株被統稱為致病性大腸埃希菌。根據其遺傳性和臨床癥狀可分為腸內致病性大腸埃希菌、腸外致病性大腸埃希菌和共生型大腸埃希菌3 個類型。其中腸外致病性大腸埃希菌（Ex?traintestinal pathogenic Escherichia coli, ExPEC）是一類能引起人和動物腸外組織感染的重要人畜共患病病原，可致使不同宿主發生腦膜炎、敗血癥、泌尿道感染和呼吸道感染[2]。它不僅可以引起豬、牛羊、禽等多種動物發病，造成養殖業嚴重經濟損失，也給人類的健康造成潛在的威脅[3]，已引起公共衛生部門的高度關注。

目前研究發現，ExPEC 抗生素耐藥性明顯高于其他菌群，50%以上菌株屬多重耐藥菌株，因此，在獸醫臨床上檢測ExPEC 分離菌株的藥敏特性及耐藥基因，對有針對性使用抗生素進行治療具有重要意義。

1 材料

1.1 病料

廣西南寧橫縣某養殖場發病仔豬。發病仔豬消瘦異常，有明顯的拉稀；剖檢發現仔豬腸系膜淋巴結腫大，腸壁變薄且有嚴重的胃腸鼓氣；開顱發現腦膜充血，大腦充血出血明顯。

1.2 試劑

營養肉湯、麥康凱瓊脂培養基，購于北京陸橋技術股份有限公司；細菌微量生化管，細菌藥敏紙片，購于杭州濱和微生物試劑有限公司；2×Es Taq Mas?terMix、電泳凝膠回收試劑盒購于北京康維世紀生物科技有限公司；DNA Ladder Marker 為TaKaRa 公司產品，5%山羊血瓊脂培養基為本實驗室制備。

1.3 試驗動物

選取8 只健康的昆明鼠，體重約為20±5g，購于廣西醫科大學實驗動物中心。

2 方法

2.1 細菌分離純化

無菌取肝臟、脾臟、腦及腸胃內容物分別劃線接種于血瓊脂培養基和麥康凱培瓊脂養基上，倒置于37℃溫室培養24h，觀察細菌生長形態和菌落顏色，挑取形態特征一致的單個菌落劃線進行純化培養，再挑取單個菌落進行革蘭染色、鏡檢。

2.2 生化試驗

將分離純化后的菌株按照操作說明書接種于硝酸鹽、硫化氫、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、枸櫞酸鹽、尿素、V-P 試驗等細菌微量生化管，置于37℃溫室培養24h，觀察并記錄生化反應結果，依據伯杰細菌鑒定手冊判定細菌生化鑒定結果[4]。

2.3 細菌16SrDNA PCR擴增及序列分析

按照常規方法提取該菌株的核酸基因組，并以此為模板，使用16SrDNA 基因的通用引物進PCR擴增，參照文獻[5]合成引物:PF:5′-AGAGTTTGATCAT?GGCT-CAG-3′；PR:5′-GTGTGACGGGCGGTGTG?TAC-3′，產物送由生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因測序，測序結果在NCBI數據庫中進行同源性比對。

2.4 藥敏試驗及耐藥基因篩查

無菌操作將菌液涂布至血瓊脂培養基上并均勻的貼上藥敏紙片，藥敏試驗結果參照美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）頒布的標準進行判斷[6]。

參照文獻[5]中的方法設計合成四環素類（tetB、tetG、CatI）、大環內酯類（ermA、ermC）、氨基糖苷類（aadA、APH3、ACC（3））、頭孢菌素類（Acrb、norA）、磺胺類（SulⅢ）、β-內酰胺類（mecA）、喹諾酮類（ge?lA）、氯霉素類（CmlA）等8 大類共15 個耐藥基因進行PCR擴增，用以篩查該菌攜帶的耐藥基因的情況。

2.5 分離菌株主要毒力基因的擴增

根據已有的文獻報道，合成粘附素類（papC、fimC）、血清類（iss、ompA、cva/cvi）、鐵轉運系統類（fyuA、iucD）、保護素（kspM）等大腸埃希菌毒力基因，引物序列見表1，由廣州華大基因科技股份有限公司合成。

2.6 小鼠致病性試驗

將分離菌株接種普通營養肉湯，37℃恒溫箱培養24h后，以不同梯度稀釋菌液并均勻的涂布在血瓊脂培養基上，通過細菌計數后得知菌液濃度約為2×10-8CFU/mL。將8 只健康昆明鼠隨機均分為兩組，試驗組每只昆明鼠通過腹腔注射菌液0.1mL，對照組每只昆明鼠通過腹腔注射營養肉湯0.1mL，觀察并記錄試驗昆明鼠發病死亡情況。

3 結果與分析

3.1 細菌分離純化及鏡檢結果

結果在肝臟、脾臟、腦內以及胃腸內容物中均分離到細菌。其中腦內分離菌疑似大腸埃希菌，該菌在血瓊脂培養基上長出灰白色、四周整齊中間稍微凸起、濕潤且光滑的中等大小菌落；在麥康凱培養基上長出如圖1所示的桃紅色、四周整齊中間凸起、圓形且濕潤的菌落。營養肉湯均出現渾濁。挑取單個菌落及營養肉湯培養物進行涂片、革蘭染色、鏡檢，可見該菌株為排列不規則、短桿狀、沒有芽孢，革蘭染色為陰性菌，見圖2。

圖1 分離菌在麥康凱培養基上的生長形態

圖2 分離菌革蘭染色觀察圖片（100×）

3.2 生化特性鑒定

將純化后的分離菌株分別進行各項生化檢測，結果見表2。由表2 可看出，分離菌可以發酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖；硫化氫、硝酸鹽、枸櫞酸鹽試驗呈陽性，不分解尿素，V-P 試驗和吲哚試驗呈陰性。該試驗結果與伯杰細菌鑒定手冊中的大腸埃希菌生化鑒定結果一致，結果可初步鑒定分離菌株為大腸埃希菌。

表2 細菌生化試驗結果

3.3 16SrDNA序列擴增及序列比對結果

以分離菌株DNA為模板，采用16SrDNA通用引物進行PCR 擴增，結果可擴增出約1500bp 的條帶，將該條帶切膠、回收后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果在NCBI 數據庫中進行序列比對，比對結果表明，分離菌與大腸埃希菌的同源性高達99.33%，進一步證明分離菌株為大腸埃希菌。

3.4 藥敏試驗及耐藥基因篩查結果

3.4.1 藥敏試驗結果 分離菌藥敏試驗結果見表3。由表3 可見該分離菌株對頭孢西叮、慶大霉素藥物極度敏感，對新霉素、米諾環素、妥布霉素、氨曲南等藥物高度敏感，對氨芐西林、磺胺異惡唑、左氟沙星、鏈霉素、四環素、乙酰螺旋霉素等藥物耐藥，該菌株為一種多重耐藥菌株。

注：抑菌圈直徑＞20mm為極敏；15 mm≤抑菌圈直徑≤20 mm為高敏；10≤抑菌圈直徑＜15mm為中敏；抑菌圈直徑＜10mm為低敏；無抑菌圈為不敏感。

3.4.2 藥基因篩查結果 由圖3 可以看出，分離菌株可通過PCR擴增出與aadA、SulⅢ片段大小相對應的目的條帶，說明該分離菌帶有addA、SulⅢ耐藥基因，與藥敏試驗結果基本一致。

圖3 耐藥基因檢測結果

3.5 分離菌株主要毒力基因的擴增結果

毒力基因擴增結果見圖4，由圖4 可以看出，分離菌株可通過PCR 擴增出與iucD、papC、fyuA、iss、kspM片段大小相對應的目的條帶，說明該分離菌帶有iucD、papC、fyuA、iss、kspM毒力基因。

圖4 毒力基因檢測結果

3.6 小鼠致病性試驗結果

攻毒18h 后，試驗組4 只昆明鼠全部死亡，對照組4只昆明鼠均健康存活。試驗組昆明鼠病死前出現精神沉郁、食欲減退、容易昏睡等。剖解死亡昆明鼠可見肝臟腫大并伴有點狀壞死、肺臟有出血點、胃腸鼓氣伴有血，腸道內充滿黃色稀便、腦充血明顯。從死亡昆明鼠體內分離菌經生化試驗和PCR 檢測與分離菌株一致，同為大腸埃希菌。

4 討論

細菌攜帶的毒力基因和耐藥基因與菌株的致病性和耐藥性有較為直接的關系,因此，檢測分離菌株的毒力基因和耐藥基因對于評估該病原菌的致病性及耐藥性以及防控策略的制定有意義。近幾年來，養殖業發展迅速，但濫用抗生素的情況也屢見不鮮，導致耐藥菌株不斷出現。本試驗分離菌株雖為自然界最為常見的大腸埃希菌，卻對大多數獸醫臨床上常用的抗生素產生耐藥，這與臨床上藥物治療效果不佳有很大關系。

毒力島(pathogenicity island)指細菌染色體上編碼毒力相關基因的特殊區域,是某些細菌在進化過程中適應環境變化而獲得的毒力基因。其中強毒力島(HPI) , 即耶爾森菌毒力島的主要結構基因是FyuA、irp1、irp2；基因irp2 為標志基因，與耶爾森氏菌的鐵攝取能力有關，基因FyuA 與耶爾森氏菌的鼠疫菌素敏感性有關[7]。莢膜是E.coli 引起腸道外感染的重要因素。當敲除了與莢膜多糖輸出相關的kpsM 基因后，豬腦炎PCN033 突變株的粘附、抗吞噬作用和抗補體介導的血清殺菌能力均顯著下降[8]。本次試驗利用PCR 技術對分離菌進行了papC、fimC、iss25、ompA、cva/cvi、fyuA、iucD、kspM 毒力基因的檢測，結果存在有papC、iss、fyuA、iucD、kspM這五個毒力基因，可以合理推測認為該菌株是致病力較強的菌特別是kspM基因，是引起腦炎的主要因素之一。本試驗分離的大腸埃希菌存在kspM基因，是引起豬發生腦炎導致死亡的重要原因。

本試驗對該分離菌進行了藥敏試驗、動物致病試驗、耐藥基因及毒力基因的PCR 擴增，均證實了該分離菌具有較強的致病性，存在多重耐藥。在治療時應選用敏感藥物進行治療。