c-erb-B2在早期胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)中的作用

蔡志強(qiáng)，蘇小巖，楊繼元

荊州市第一人民醫(yī)院腫瘤科，湖北 荊州434000

早期胃癌為局限于黏膜及黏膜下層的病變。有研究認(rèn)為，早期胃癌的復(fù)發(fā)與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)[1]，但對(duì)于早期胃癌復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)，目前尚無(wú)確切的分子生物標(biāo)志物。C‐erb‐B2也稱人表皮生長(zhǎng)因子受 體 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）或HER2/neu，是位于17號(hào)染色體上的原癌基因，其編碼一種185 kD的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，是表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族成員[2‐3]。c-erb-B2擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)對(duì)于促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用[2‐4]。本研究分析了早期胃癌復(fù)發(fā)與患者臨床特征的關(guān)系，探討了c‐erb‐B2在早期胃癌復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年1月至2015年12月荊州市第一人民醫(yī)院收治的178例經(jīng)手術(shù)切除早期胃癌術(shù)后患者的胃癌組織標(biāo)本，所有患者的隨訪資料均完整。參照日本胃癌研究學(xué)會(huì)（Japanese Research So‐ciety for Gastric Cancer，JRSGC）中關(guān)于早期胃癌的根治手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行手術(shù)[5]。早期胃癌分型：隆起型、凹陷型、扁平型、混合型。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Commit‐tee on Cancer，AJCC）中關(guān)于胃癌的分期標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.2 檢測(cè)方法

采用免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemi‐cal，IHC）和熒光原位雜交（ fluorescence in situ hy‐bridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)檢測(cè)c‐erb‐B2蛋白的表達(dá)情況和c-erb-B2基因的擴(kuò)增狀態(tài)。最終判定標(biāo)準(zhǔn)：IHC檢測(cè)結(jié)果為強(qiáng)表達(dá)（＋＋＋），則直接確定為c‐erb‐B2陽(yáng)性；IHC檢測(cè)結(jié)果為陰性表達(dá)（-）和弱表達(dá)（＋），則直接判定為c‐erb‐B2陰性；IHC檢測(cè)結(jié)果為中度表達(dá)（＋＋）則判定為不確定，須進(jìn)一步應(yīng)用FISH行c-erb-B2基因擴(kuò)增狀態(tài)檢測(cè)（但仍可能出現(xiàn)結(jié)果不能確定的情況）。由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的胃腸病理學(xué)專家在不知情的情況對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行審查和分析，當(dāng)閱片結(jié)果不一致時(shí)，通過(guò)FISH檢測(cè)明確c-erb-B2基因的擴(kuò)增情況。

1.2.1 IHC檢測(cè)所有胃癌組織標(biāo)本均經(jīng)福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。采用MaxEnVision法進(jìn)行IHC，3 μm 厚切片，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzi‐dine，DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。采用美國(guó)食品和藥品管理局（Food and Drug Adminis‐tration，F(xiàn)DA）認(rèn)證的IHC試劑盒對(duì)c‐erb‐B2進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照抗體使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。對(duì)每張載玻片上的免疫染色進(jìn)行評(píng)分[7]，細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為c‐erb‐B2陽(yáng)性表達(dá)。隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，采用200倍光學(xué)顯微鏡觀察IHC結(jié)果。IHC檢測(cè)結(jié)果判定：細(xì)胞膜均未著色或≤10%的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜出現(xiàn)淡黃色顆粒，為陰性表達(dá)（-）；＞10%的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜呈淡黃色或存在隱約可見(jiàn)的細(xì)胞膜染色，染色間斷，未包繞細(xì)胞膜，為弱表達(dá)（＋）；＞10%的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜呈黃色或棕黃色顆粒，染色連續(xù)，包繞細(xì)胞膜，為弱至中等強(qiáng)度表達(dá)（＋＋）；＞10%的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜呈深棕色，染色連續(xù)，包繞細(xì)胞膜，為強(qiáng)表達(dá)（＋＋＋）。

1.2.2 FISH檢測(cè)c-erb-B2基因FISH試劑、探針及FISH操作步驟：石蠟包埋胃癌組織切片的預(yù)處理程序、操作步驟均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，c‐erb‐B2 Hercep TestTMKit pharmDx TM Kit購(gòu)自Dako Cyto‐mation公司。c-erb-B2基因的雜交信號(hào)顯示為綠色，17號(hào)染色體著絲粒區(qū)（chromosome 17 centro‐mere locus，CEP17）的雜交信號(hào)顯示為橘紅色。在熒光顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)并觀察3個(gè)區(qū)域的陽(yáng)性信號(hào)，每個(gè)區(qū)域至少計(jì)數(shù)20個(gè)以上腫瘤細(xì)胞核內(nèi)的c‐erb‐B2 信號(hào)點(diǎn)數(shù)和 CEN17 信號(hào)點(diǎn)數(shù)，計(jì)算平均值。以c‐erb‐B2/CEN17信號(hào)點(diǎn)數(shù)的比值確定c-erb-B2的狀態(tài)，c‐erb‐B2/CEN17＜1.8提示無(wú)c-erb-B2基因擴(kuò)增，c‐erb‐B2/CEN17≥2.2表示c-erb-B2基因擴(kuò)增，c‐erb‐B2/CEN17處于 1.8～2.1 之間則判定為可疑[8]。若FISH檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則判定為c-erb-B2陽(yáng)性；若FISH檢測(cè)結(jié)果為陰性，則判定為c-erb-B2陰性。

1.3 隨訪

對(duì)所有患者出院后進(jìn)行常規(guī)隨訪。前2年每3個(gè)月隨訪一次，第3～5年每6個(gè)月隨訪一次，5年后每年隨訪一次，隨訪截至2017年12月。記錄局部復(fù)發(fā)、腹膜復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)（包括其他器官轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處淋巴結(jié)復(fù)發(fā)和混合模式）情況。采用計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）、內(nèi)窺鏡活檢和正電子發(fā)射斷層成像（positron emission tomography，PET）‐CT檢查觀察復(fù)發(fā)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征的早期胃癌患者復(fù)發(fā)情況的比較

178例早期胃癌患者中，14例（7.87%）患者于隨訪期間復(fù)發(fā)，包括局部復(fù)發(fā)8例、遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)5例、腹膜復(fù)發(fā)1例。不同性別、腫瘤浸潤(rùn)深度的早期胃癌患者的復(fù)發(fā)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.834、4.705，P＜0.05）；不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的早期胃癌患者的復(fù)發(fā)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同年齡、分化類型、手術(shù)方式、腫瘤位置、腫瘤分型和腫瘤直徑的早期胃癌患者的復(fù)發(fā)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

2.2 早期胃癌組織中c-erb-B2蛋白的表達(dá)情況

IHC結(jié)果顯示，178例胃癌患者中，c‐erb‐B2陽(yáng)性患者13例（8例復(fù)發(fā)），c‐erb‐B2可疑陽(yáng)性患者6例（4例復(fù)發(fā)），c‐erb‐B2陰性患者 159例（2例復(fù)發(fā)）。不同c‐erb‐B2表達(dá)情況（c‐erb‐B2陽(yáng)性、可疑陽(yáng)性和陰性）胃癌患者的復(fù)發(fā)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。c‐erb‐B2陽(yáng)性和可疑陽(yáng)性的胃癌患者的復(fù)發(fā)率均高于c‐erb‐B2陰性胃癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而c‐erb‐B2陽(yáng)性與可疑陽(yáng)性胃癌患者的復(fù)發(fā)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖1）

2.3 c-erb-B2基因可疑陽(yáng)性早期胃癌患者的FISH檢測(cè)結(jié)果

FISH檢測(cè)結(jié)果顯示，IHC結(jié)果為c‐erb‐B2可疑陽(yáng)性的6例早期胃癌患者中，c-erb-B2擴(kuò)增患者5例（復(fù)發(fā)4例，未復(fù)發(fā)1例），c-erb-B2未擴(kuò)增患者1例（未復(fù)發(fā)）。5例c-erb-B2擴(kuò)增的早期胃癌患者與1例c-erb-B2未擴(kuò)增的早期胃癌患者的復(fù)發(fā)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖2）

2.4 c-erb-B2基因狀態(tài)與早期胃癌患者復(fù)發(fā)的關(guān)系

178例早期胃癌患者中，18例患者c‐erb‐B2陽(yáng)性，包括復(fù)發(fā)患者12例和未復(fù)發(fā)患者6例；160例患者c‐erb‐B2陰性，包括復(fù)發(fā)患者2例，未復(fù)發(fā)患者158例。c‐erb‐B2陽(yáng)性早期胃癌患者的復(fù)發(fā)率為66.67%，明顯高于c‐erb‐B2陰性患者的1.25%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=86.733，P＜0.01）。

表1 不同臨床特征早期胃癌患者的復(fù)發(fā)情況（ n=178）

圖1 早期胃癌組織中c‐erb‐B2蛋白的表達(dá)情況（免疫組化染色，×40）

圖2 熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)c-erb-B2的擴(kuò)增情況（DAPI染色，×1000）

3 討論

胃癌是全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的第二大原因，東亞國(guó)家晚期胃癌的病死率最高[9‐10]。相比之下，早期胃腺癌患者的5年生存率達(dá)90%以上[11]，這歸因于早期上消化道內(nèi)鏡篩查[12]。臨床特征可預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)情況，Sawayama等[13]分析了429例未行術(shù)前化療而行胃癌根治性切除術(shù)患者的臨床特征與早期胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，429例患者中，有57例患者復(fù)發(fā)，且性別、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、淋巴浸潤(rùn)、血管浸潤(rùn)與早期胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)可能有關(guān)。

Chapelle等[14]研究發(fā)現(xiàn)，性別、淋巴結(jié)受侵情況是影響早期胃癌預(yù)后的重要因素。Liu等[15]發(fā)現(xiàn)腫瘤位置、區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯是胃腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究發(fā)觀，年齡、分化類型、手術(shù)方式、腫瘤位置、腫瘤分型和腫瘤直徑可能與早期胃癌的復(fù)發(fā)無(wú)關(guān)，但性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和腫瘤浸潤(rùn)深度可能與早期胃癌的復(fù)發(fā)有關(guān)。分子標(biāo)記物與胃癌復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)有關(guān)。c-erb-B2基因能夠預(yù)測(cè)早期胃癌患者的預(yù)后，其陽(yáng)性率可能與早期胃癌患者的性別、腫瘤部位、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度等有關(guān)[16‐17]。Kim 等[18]發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)組 c‐erb‐B2的陽(yáng)性率約為18.8%（6/32）。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)患者的 c‐erb‐B2陽(yáng)性率為85.7%（12/14），這可能與c‐erb‐B2的檢測(cè)方法存在差異有關(guān)。IHC在蛋白質(zhì)水平檢測(cè)c‐erb‐B2的表達(dá)，由于蛋白質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定，在組織固定時(shí)會(huì)使抗原活性下降或消失，從而導(dǎo)致假陰性。FISH則是在DNA水平上檢測(cè)c-erb-B2基因的表達(dá)，DNA性質(zhì)穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)不易破壞，直觀、高度靈敏的熒光信號(hào)使不同操作者之間的判讀差異減小。

IHC具有價(jià)格低廉、方法簡(jiǎn)便、快速、可使用普通光學(xué)顯微鏡觀察、標(biāo)本可較長(zhǎng)時(shí)間常溫保存等優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)c‐erb‐B2蛋白的首選方法，但其容易受到如標(biāo)本處理、試劑、儀器及人員等因素的干擾，且其僅是一種半定量檢測(cè)方法，影響IHC結(jié)果的準(zhǔn)確性。FISH具有特異性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中受到的影響較小，是檢測(cè)c-erb-B2基因狀態(tài)更加可靠的方法。2007年，美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)/美國(guó)病理學(xué)家學(xué)院指南推薦 IHC 和 FISH 作為 c‐erb‐B2的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)。Kim等[18]研究中c-erb-B2基因的陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為IHC檢測(cè)結(jié)果為2+和（或）IHC檢測(cè)結(jié)果為3+，而本研究采用IHC和FISH聯(lián)合檢測(cè)基因c-erb-B2的狀態(tài)，其陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為IHC3+和（或）FISH擴(kuò)增。有文獻(xiàn)報(bào)道，IHC檢測(cè)結(jié)果為2+時(shí)，HER2基因的擴(kuò)增率為12%～15%[19]。Kim等[18]的研究中，部分IHC檢測(cè)結(jié)果為2+的患者未進(jìn)行FISH檢測(cè)，故造成HER2基因陽(yáng)性率偏低。

綜上所述，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)早期胃癌復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)性較高，同樣，c‐erb‐B2有助于預(yù)測(cè)早期胃癌復(fù)發(fā)。由于本研究納入的病例數(shù)量有限，c-erb-B2基因在早期胃癌復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)中的應(yīng)用仍需前瞻性研究進(jìn)一步證實(shí)。