半乳糖凝集素- 9和T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3在口腔扁平苔蘚和口腔鱗狀細胞癌組織中的表達及臨床意義

王輝，張利娟，楊芳

1青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，山東 青島266071

2青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)療中心，山東青島266071

口腔扁平苔蘚是一種常見的炎性口腔黏膜疾病，多發(fā)生于中年女性，臨床表現(xiàn)為小丘疹連成條狀白色或花白色紋路，多呈對稱性分布，嚴重者病損區(qū)還伴有萎縮糜爛的現(xiàn)象。臨床研究顯示，糜爛型口腔扁平苔蘚約有0.5%的癌變率，因此，將口腔扁平苔蘚定義為癌前狀態(tài)[1]。據(jù)報道，T細胞介導(dǎo)的免疫功能障礙與口腔扁平苔蘚的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（T‐cell immunoglobulin mucin family member 3，TIM3）是輔助性T細胞（helper T cell，Th）1/Th2的特異性表面標志，半乳糖凝集素‐9（Galectin‐9）是TIM3的配體，研究發(fā)現(xiàn)TIM3/Galectin‐9途徑在機體免疫調(diào)節(jié)、逃逸及耐受中具有重要作用[3]。目前有關(guān)TIM3表達與口腔鱗狀細胞癌關(guān)系的報道較多[4‐5]，但有關(guān)Galectin‐9和TIM3在口腔扁平苔蘚和口腔鱗狀細胞癌中表達情況的相關(guān)研究較少。本研究分析Galectin‐9和TIM3在口腔扁平苔蘚及口腔鱗狀細胞癌中的表達情況及與患者臨床特征的關(guān)系，旨在探索口腔扁平苔蘚向口腔鱗狀細胞癌發(fā)展的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年9月至2018年9月青島市市立醫(yī)院收治的口腔扁平苔蘚和口腔鱗狀細胞癌患者。納入標準：①通過臨床表現(xiàn)和病理檢查首次確診為口腔扁平苔蘚或口腔鱗狀細胞癌；②病理組織標本保存完整。排除標準：①合并其他口腔黏膜疾病；②合并重要器官（心、肝、腎等）功能障礙；③合并其他腫瘤；④具有先天性免疫疾病；⑤月經(jīng)期、妊娠期或哺乳期女性；⑥使用過抗生素、皮質(zhì)激素和免疫相關(guān)藥物。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入42例口腔扁平苔蘚患者和25例口腔鱗狀細胞癌患者，分別作為口腔扁平苔蘚組和口腔鱗狀細胞癌組。另選擇30例口腔黏膜正常者（因外傷或美容需要行口內(nèi)黏膜手術(shù)）作為對照組。口腔扁平苔蘚組中，男16例，女26例；年齡21～65歲，平均年齡（48.51±15.49）歲；病理類型：糜爛型20例，非糜爛型22例。口腔鱗狀細胞癌組中，男10例，女15例；年齡42～74歲，平均年齡（51.37±14.56）歲；分化程度：高分化6例，中分化9例，低分化10例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例。對照組中，男12例，女18例；年齡25～60歲，平均年齡（49.82±12.47）歲。3組研究對象的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法

將組織蠟塊切成4 μm薄片，置于60℃烤箱中烘烤1 h，滴加二甲苯（完全覆蓋組織切片）進行脫蠟，依次放入梯度乙醇中水化，然后將組織切片放入檸檬酸鹽緩沖液中，高溫加熱2 min，修復(fù)抗原；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后滴加3%過氧化氫，孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶的活性；PBS清洗后加入PV‐9000試劑盒中的山羊血清，室溫孵育30 min，封閉非特異性位點；滴加稀釋后的一抗（Galectin‐9和TIM3的稀釋比例均為1∶100），4℃孵育過夜；PBS清洗后滴加試劑盒中的二抗，37℃孵育30 min；PBS清洗后滴加試劑盒中辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min；PBS清洗后滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液進行顯色，待顯微鏡下觀察到明顯陽性染色而背景色較淺時終止顯色；將組織置于蘇木素中復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷標準

由2名資深病理醫(yī)師采用雙盲法[6]閱片，判斷各切片的染色情況，光鏡下Galectin‐9和TIM3均定位于細胞質(zhì)或細胞核，陽性表達呈棕黃色或淡黃色顆粒。依據(jù)染色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，褐色為3分。依據(jù)陽性細胞比例評分：≤10%為0分，11%～30%為1分，31%～70%為2分，＞70%為3分。染色強度評分與陽性細胞比例評分相加，0～1分為陰性表達，≥2分為陽性表達[7]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK‐q檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同類型口腔組織中Galectin- 9和TIM 3表達情況的比較

Galectin‐9和TIM3在口腔細胞中的陽性表達主要位于細胞質(zhì)或細胞核。正常口腔黏膜組織、口腔扁平苔蘚組織及口腔鱗狀細胞癌組織中Ga‐lectin‐9和TIM3的表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。口腔鱗狀細胞癌組織中Galectin‐9的陽性表達率低于口腔扁平苔蘚組織和正常口腔黏膜組織，TIM3的陽性表達率高于正常口腔黏膜組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；口腔扁平苔蘚組織中Galectin‐9的陽性表達率低于正常口腔黏膜組織，TIM3的陽性表達率高于正常口腔黏膜組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 3種口腔組織中Galectin‐ 9和TIM 3表達情況的比較[ n（%）]

2.2 不同臨床特征口腔扁平苔蘚患者口腔扁平苔蘚組織中Galectin- 9和TIM 3表達情況的比較

不同年齡、性別口腔扁平苔蘚患者口腔扁平苔蘚組織中Galectin‐9和TIM3的表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。糜爛型口腔扁平苔蘚患者口腔扁平苔蘚組織中Galectin‐9的陽性表達率低于非糜爛型口腔扁平苔蘚患者，TIM3的陽性表達率高于非糜爛型口腔扁平苔蘚患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.988、4.400，P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征口腔扁平苔蘚患者口腔扁平苔蘚組織中Galectin‐ 9和TIM 3的表達情況（ n=42）

2.3 不同臨床特征口腔鱗狀細胞癌患者口腔鱗狀細胞癌組織中Galectin- 9和TIM 3表達情況的比較

不同年齡、性別口腔鱗狀細胞癌患者口腔鱗狀細胞癌組織中Galectin‐9的表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。不同年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況口腔鱗狀細胞癌患者口腔鱗狀細胞癌組織中TIM3的表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況口腔鱗狀細胞癌患者口腔鱗狀細胞癌組織中Galectin‐9的表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.796、6.173，P＜0.05）；不同分化程度口腔鱗狀細胞癌患者口腔鱗狀細胞癌組織中TIM3的表達情況比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.884，P＜0.05）。（表3）

2.4 口腔扁平苔蘚及口腔鱗狀細胞癌患者中Galectin- 9和TIM 3表達的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，口腔扁平苔蘚和口腔鱗狀細胞癌患者中Galectin‐9和TIM3的表達均呈負相關(guān)（r=-0.415、-0.437，P＜0.01）。

表3 不同臨床特征口腔鱗狀細胞癌患者口腔鱗狀細胞癌組織中Galectin‐ 9和TIM 3的表達情況（ n=25）

3 討論

目前，口腔扁平苔蘚的發(fā)病機制尚不明確，但文獻顯示，口腔扁平苔蘚患者病損處、唾液及組織滲出液等均表現(xiàn)出Th1/Th2的失衡[8‐9]，提示Th1/Th2可能通過抑制機體的細胞免疫應(yīng)答，參與口腔扁平苔蘚的發(fā)生發(fā)展。TIM3基因可特異性表達于Th1細胞表面，直接參與T細胞的免疫應(yīng)答，TIM3還可表達于其他免疫細胞，如單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等，介導(dǎo)炎性反應(yīng)而發(fā)揮促炎作用[10]。丁思思等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TIM3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清和關(guān)節(jié)滑液中的表達水平顯著高于健康者，提示高表達的TIM3可抑制機體細胞免疫功能，從而參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。Deng等[12]研究發(fā)現(xiàn)，抑制TIM3的表達可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。上述文獻均表明，TIM3在多種免疫性疾病和惡性腫瘤中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，TIM3在正常口腔黏膜組織、口腔扁平苔蘚組織及口腔鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率逐漸升高，提示TIM3在扁平苔蘚病損形成及癌變過程中具有重要作用，可能是由于TIM3介導(dǎo)免疫應(yīng)答導(dǎo)致扁平苔蘚炎癥反應(yīng)遷延反復(fù)。本研究結(jié)果還顯示，TIM3在糜爛型口腔扁平苔蘚患者、中‐低分化口腔鱗狀細胞癌患者中的陽性表達率較高，進一步表明TIM3可能參與口腔黏膜的早期癌變過程。

Gaectin‐9是TIM3的配體，主要表達于巨噬細胞、樹突狀細胞中，參與調(diào)節(jié)細胞分化、凋亡、黏附、聚集及炎性反應(yīng)[13]。研究顯示，Galectin‐9結(jié)合TIM3后可以選擇性地清除抗原特異性Th1細胞，誘導(dǎo)其凋亡，終止Th1細胞的免疫功能，提示TIM3/Galectin‐9途徑可控制Th1細胞的數(shù)量及功能[14]。方政等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Galectin‐9可通過介導(dǎo)免疫應(yīng)答抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖和侵襲，并誘導(dǎo)其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，Galectin‐9在正常口腔黏膜組織、口腔扁平苔蘚組織及口腔鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率逐漸降低，推測口腔扁平苔蘚及口腔鱗狀細胞癌患者中Galectin‐9表達水平較低，無法清除大量活化的Th1細胞，從而引起病理損傷。同時，Galectin‐9在糜爛型扁平苔蘚患者和低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的口腔鱗狀細胞癌患者中的陽性表達率較低，提示Galectin‐9可能在口腔黏膜早期癌變過程中具有重要作用。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，口腔扁平苔蘚和口腔鱗狀細胞癌患者中Galectin‐9和TIM3的表達均呈負相關(guān)（P＜0.01），進一步驗證了上述TIM3/Galectin‐9途徑的作用。

綜上所述，口腔扁平苔蘚的發(fā)生發(fā)展涉及多因素、多分子的共同作用，TIM3/Galectin‐9途徑在多種Th1表達異常的疾病中均存在異常。Galectin‐9和TIM3可能參與口腔扁平苔蘚及口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展，并可能與口腔扁平苔蘚的癌變有關(guān)，但TIM3、Galectin‐9在口腔扁平苔蘚患者全身的表達情況及具體作用機制尚不清楚，還需進一步研究。