miRNA-574- 5 p通過靶基因高溫需求因子 A 1調控肝癌細胞增殖、侵襲、遷移的分子機制

朱瓊瓊，陳雅寧，盧文杰，董賢明

河南省第二人民醫院1消化內科，2呼吸內科，鄭州451191

肝癌是臨床中常見的消化道惡性腫瘤之一，發病率居世界第5位，死亡率居世界第3位。近年來，肝癌的發病率和病死率逐年上升，但目前仍缺乏有效的防治方法[1]。微小RNA（microRNA，miR‐NA）通過與靶基因的3'UTR結合調控靶基因的轉錄后水平，進而參與調控細胞的增殖、分化、凋亡等過程。miRNA‐574‐5p已被證實在宮頸癌和乳頭狀甲狀腺癌的增殖、侵襲、轉移中發揮重要作用，其在腫瘤組織中的表達水平較高，下調其表達可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移，促進細胞凋亡[1‐3]。哺乳動物高溫需求因子A1（high temperature require‐ment factor A1，HTRA1）作為一種分泌蛋白，與細胞外基質的降解密切相關[4]。研究報道，HTRA1參與食管癌、肝癌等疾病的發展過程，食管癌組織中HTRA1的表達水平明顯低于癌旁組織，肝癌組織中HTRA1mRNA的表達水平明顯低于癌旁組織[5‐6]。但miRNA‐574‐5p在肝癌細胞中的表達情況及其對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，且其是否通過靶向調控HTRA1的表達影響肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲目前尚未可知。因此，本研究通過生物學技術，探究miRNA‐574‐5p和HTRA1在肝癌細胞中的表達情況，以及miRNA‐574‐5p是否通過靶向調控HTRA1的表達影響肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

肝癌細胞株HepG2、SMMC‐7721、BEL‐7402和正常肝細胞株L02均由上海細胞庫提供，DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自北京康為世紀生物科技有限公司，Trizol試劑購自美國Ambion公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自美國Sigma公司，二喹啉甲酸（bicin‐choninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒購自美國Pierce公司，CCK‐8購自上海碧云天生物技術研究所，慢病毒載體pGCL購自上海吉凱基因化學技術有限公司，LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen 公司，HTRA1、細胞周期蛋白 D1（cyclin D1）、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2、MMP9、MMP14、p21、p27、甘油醛‐3‐磷酸脫氫酶（glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗均購自美國Santa Cruz公司，免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）二抗購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養L02、HepG2、SMMC‐7721、BEL‐7402細胞均采用含10%胎牛血清和雙抗（青霉素100 U/ml，鏈霉素 100 μg/ml）的 DMEM 高糖培養基，置于5% CO2、37℃飽和濕度的細胞培養箱中進行培養。

1.2.2 載體構建、細胞轉染與細胞分組構建anti‐miRNA‐574‐5p 及陰性對照質粒 anti‐miRNA‐NC、miRNA‐574‐5p mimic、miRNA‐NC，同時構建 si‐HTRA1及其陰性對照質粒si‐NC、pcDNA‐HTRA1及其對照質粒pcDNA。于6孔板中接種3×105/孔，CO2培養箱中37℃孵育過夜；細胞密度達到50%～80%時，加入無血清培養基中培養6 h，Lipofectami‐neTM2000瞬時轉染，轉染后4～6 h更換新鮮培養基，于熒光顯微鏡下觀察轉染效率。獲得穩定低表達miRNA‐574‐5p的 anti‐miRNA‐574‐5p細胞株，標記為anti‐miRNA‐574‐5p組，其陰性對照anti‐miRNA‐NC細胞株標記為anti‐miRNA‐NC組，過表達miR‐NA‐574‐5p 的 miRNA‐574‐5p 細胞株標記為 miR‐NA‐574‐5p組，對照miRNA‐NC細胞株標記為miR‐NA‐NC組，以及HTRA1過表達的細胞株標記為pcDNA‐HTRA1組及其對照細胞株標記為pcDNA組。同時，在穩定低表達的 anti‐miRNA‐574‐5p 細胞株的基礎上轉染HTRA1低表達si‐HTRA1獲得穩定細胞株 anti‐miRNA‐574‐5p+si‐HTRA1（anti‐miRNA‐574‐5p+si‐HTRA1 組）和 anti‐miRNA‐574‐5p+si‐NC（anti‐miRNA‐574‐5p+si‐NC 組）。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction ，PCR）檢測miRNA-574- 5 p、HTRA 1表達情況收集處于對數生長期的細胞，采用Trizol試劑提取總RNA，反轉錄成cD‐NA，采用ABI7500型PCR儀進行實時熒光定量PCR，反應體系：95℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃20 s，72 ℃20 s，共 40個循環。miRNA‐574‐5p的上游引物為 3'‐TACGATGAGTGTGTGTGTGTGAGTGT‐5'，下游引物為 5'‐GTCCTTGGTGCCCGAGTG‐3'；U6 的上游引物為 5'‐TACGAGTGCTCACTTCG‐GCAGC‐3'，下游引物為5'‐AACGCTTCAC‐GAATTTGCGT‐3'。HTRA1的 上游引 物 為 3'‐TG‐GAAACTCGGGAGGCCCGTT‐5'，下游引物為 5'‐TGGCTTTGCTGGACGTGAGTGAC‐3'；GAPDH的上游引物為 5'‐AGAAGGCTGGGGCTCATTTG‐3'，下游引物為5'‐AGGGGCCATCCACAGTCTTC‐3'。分別以U6、GAPDH為miRNA‐574‐5p、HTRA1 的內參基因，采用 2-ΔΔCt法計算 miRNA‐574‐5p、HTRA1的表達水平。實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 蛋白質印跡法（Western blot）檢測蛋白表達情況采用RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度并稀釋蛋白，進行十二烷基硫酸鈉‐聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sul‐phate‐polyacryl amide gel electrophoresis，SDS‐PAGE）凝膠電泳，轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinyli‐dene fluoride，PVDF）膜；室溫脫脂奶粉封閉1 h；添加稀釋適當比例的一抗，4℃孵育過夜，TBST清洗3次；二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3次；滴加電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）顯影液，使用Image Quant LAS4010凝膠成像儀觀察目的蛋白條帶，采集圖片。分析條帶灰度值，以GAPDH為內參，采用Western blot檢測轉染后HepG2細胞中HTRA1、cyclin D1、p21、p27、MMP2、MMP9、MMP14蛋白的表達水平。

1.2.5 噻唑藍法檢測HepG 2細胞增殖情況調整待測細胞濃度至5×103/ml接種于96孔板中，每孔100 μl，分別于 24、48、72 h 檢測細胞增殖情況；棄去培養基，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered sa‐line，PBS）清洗細胞，每孔加入噻唑藍（methylthia‐zolyl tetrazolium，MTT）試劑20 μl，室溫孵育42 h，離心留下層細胞，每孔加入100 μl DMSO振蕩孵育15 min，采用酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度值，計算細胞增殖率。

1.2.6 Transwell實驗檢測 HepG 2細胞遷移和侵襲能力遷移實驗：轉染后細胞，以每孔104個細胞加入Transwell上室，下室加入含5% FBS的DMEM，5% CO2、37℃條件下培養；12 h后取出小室，棄去培養基，棉簽擦去未穿過細胞，90%乙醇固定10 min，0.1%結晶紫溶液染色5 min，PBS清洗；隨機選擇5個低倍鏡視野進行觀察，計算穿膜細胞數目。侵襲實驗：提前將Matrigel膠置于冰上解凍，并按照1∶2的體積比與無血清DMEM培養基混勻制備Matrigel基質膠；Matrigel基質膠包被Transwell小室，以每孔104個細胞加入Transwell上室，其余操作同遷移實驗。

1.2.7 雙熒光素酶實驗檢測miRNA-574- 5 p對HTRA 1的影響構建野生型pGL3‐HTRA1‐3'UTR（WT‐HTRA1 3'UTR）和突變型pGL3‐HTRA1‐3'UTR（MUT‐pGL3‐HTRA1‐3'UTR）表達載體，將構建后的載體采用LipofectamineTM2000瞬時轉染至anti‐miRNA‐NC、anti‐miRNA‐574‐5p HepG2 細胞，分別標記為 miRNA‐NC+WT‐HTRA1 組、miRNA‐574‐5p+WT‐HTRA1 組 、miRNA‐NC+MUT‐HTRA1組 和 miRNA‐574‐5p+MUT‐HTRA1 組 。 轉 染 后48 h，采用熒光素酶活性檢測儀測定熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性為內參，計算熒光素酶的相對活性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-574- 5 p、HTRA 1 mRNA和HTRA 1蛋白在肝癌細胞和正常肝細胞中的表達情況

L02、HepG2、SMMC‐7721和BEL‐7402細胞中miRNA‐574‐5p、HTRA1mRNA和HTRA1蛋白的表達水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與L02細胞系比較，肝癌細胞系HepG2、SMMC‐7721、BEL‐7402 中 miRNA‐574‐5p 的表達水平均升高，HTRA1mRNA和HTRA1蛋白的表達水平均下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同細胞中miRNA‐574‐ 5 p、HTRA 1 mRNA和HTRA 1蛋白表達水平的比較（± s）

表1 不同細胞中miRNA‐574‐ 5 p、HTRA 1 mRNA和HTRA 1蛋白表達水平的比較（± s）

注：*與L02比較，P＜0.05

細胞L 0 2 H e p G 2 S M M C‐7 7 2 1 B E L‐7 4 0 2 F值P值1.0 0±0.0 9 4.0 2±0.3 8*3.2 2±0.3 1*3.6 5±0.3 5*2 3 7.4 9 0＜0.0 1 1.0 1±0.0 8 0.3 3±0.0 3*0.4 9±0.0 5*0.4 2±0.0 4*3 9 2.8 0 7＜0.0 1 0.8 4±0.0 8 0.5 1±0.0 5*0.4 3±0.0 4*0.5 9±0.0 6*1 0 7.2 0 6＜0.0 1 m i R N A‐5 7 4‐5 p H T R A 1 m R N A H T R A 1蛋白

2.2 抑制miRNA-574- 5 p表達對肝癌HepG 2細胞增殖能力及相關蛋白的影響

anti‐miRNA‐574‐5p 組 HepG2 細胞中 miRNA‐574‐5p的表達水平為（0.32±0.03），明顯低于anti‐miRNA‐NC組的（1.01±0.09），差異有統計學意義（t=17.816，P＜0.01）。與anti‐miRNA‐NC 組比較，anti‐miRNA‐574‐5p組培養48、72 h 的 HepG2 細胞的增殖率均明顯降低，cyclin D1蛋白的表達水平明顯降低，p21、p27蛋白的表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表2）

2.3 抑制miRNA-574- 5 p表達對肝癌HepG 2細胞遷移、侵襲及MMP相關蛋白的影響

與anti‐miRNA‐NC組比較，anti‐miRNA‐574‐5p組HepG2細胞的遷移、侵襲數目及MMP2、MMP9、MMP14蛋白的表達水平均明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表3）

2.4 HTRA 1過表達對肝癌HepG 2細胞增殖、遷移和侵襲的影響

pcDNA‐HTRA1組HepG2細胞中HTRA1蛋白的表達水平為（0.81±0.08），明顯高于pcDNA組的（0.48±0.05），差異有統計學意義（t=8.568，P＜0.01）。與pcDNA組比較，pcDNA‐HTRA1組HepG2細胞48、72 h的增殖率明顯降低，cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白的表達水平均明顯降低，p21蛋白的表達水平明顯升高，遷移、侵襲數目明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表4）

2.5 miRNA-574- 5 p靶向調控HTRA 1的表達

Target Scan生物信息學軟件預測顯示，miR‐NA‐574‐5p與HTRA1的3'UTR區域存在結合位點，提示HTRA1的3'UTR中含有與miRNA‐574‐5p互補的核苷酸序列（圖 1），根據 miRNA‐574‐5p與HTRA1的潛在結合位點，構建 WT‐HTRA1‐3'UTR和MUT‐HTRA1‐3'UTR質粒，雙熒光素酶報告實驗顯示，miRNA‐574‐5p+WT‐HTRA1組 HepG‐2細胞的熒光素酶活性為（0.42±0.04），明顯低于miRNA‐NC+WT‐HTRA1組的（1.01±0.09），差異有統計學意義（t=14.674，P＜0.01）。miRNA‐574‐5p+MUT‐HTRA1組HepG‐2細胞的熒光素酶活性為（1.02±0.09），與 miRNA‐NC+MUT‐HTRA1組的（1.04±0.08）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。West‐ern blot檢測結果顯示，miRNA‐574‐5p組HepG‐2細胞中HTRA1蛋白的表達水平為（0.21±0.02），低于miRNA‐NC組的（ 0.53±0.05），差異有統計學意義（P＜0.05）；anti‐miRNA‐574‐5p 組 HepG‐2 細胞中HTRA1蛋白的表達水平為（0.89±0.08），高于anti‐miRNA‐NC組的（0.50±0.05），差異有統計學意義（P＜0.05）；4組HepG‐2細胞中HTRA1蛋白的表達水平比較，差異有統計學意義（F=315.763，P＜0.01），進一步證實了 miRNA‐574‐5p可直接下調HTRA1的表達。

2.6 抑制HTRA 1表達逆轉抑制miRNA-574- 5 p表達對肝癌HepG 2細胞增殖、遷移、侵襲的作用

anti‐miRNA‐NC 組、anti‐miRNA‐574‐5p 組、an‐ti‐miRNA‐574‐5p+si‐NC 組和 anti‐miRNA‐574‐5p+si‐HTRA1組HepG2細胞中HTRA1蛋白的的表達水平分別為（0.52±0.05）、（0.84±0.08）、（0.87±0.08）、（0.66±0.06），差異均有統計學意義（F=68.127，P＜0.01）。不同組別HepG2細胞的增殖（48、72 h）、遷移、侵襲及相關蛋白的表達情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與anti‐miR‐NA‐NC組比較，anti‐miRNA‐574‐5p組HTRA1蛋白的表達水平升高，培養48、72 h的肝癌HepG2細胞的增殖率均降低，cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白的表達水平均下降，細胞遷移、侵襲數目均減少，p21蛋白的表達水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與 anti‐miRNA‐574‐5p+si‐NC 組比較，anti‐miRNA‐574‐5p+si‐HTRA1組HTRA1蛋白的表達水平降低，培養48、72 h肝癌HepG2細胞的增殖率均升高，cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白的表達水平均升高，遷移、侵襲細胞數目均增多，p21蛋白的表達水平降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表5）

表2 不同組別肝癌HepG 2細胞的增殖率及增殖相關蛋白表達水平的比較（± s）

表2 不同組別肝癌HepG 2細胞的增殖率及增殖相關蛋白表達水平的比較（± s）

組別a n t i‐m i R N A‐N C組a n t i‐m i R N A‐5 7 4‐5 p組t值P值5 4.2 8±5.0 3 4 8.6 5±4.2 8 1.2 9 9＞0.0 5 6 5.3 5±6.2 8 3 4.5 6±3.2 5 6.5 4 9＜0.0 1 7 7.2 5±7.0 6 2 9.6 5±2.8 6 1 1.3 2 3＜0.0 1 0.6 3±0.0 6 0.2 6±0.0 3 1 3.5 1 1＜0.0 1 0.3 1±0.0 3 0.7 2±0.0 7 1 3.1 8 7＜0.0 1 0.2 8±0.0 3 0.6 7±0.0 6 1 4.2 4 1＜0.0 1增殖率（%）2 4 h 4 8 h 7 2 h c y c l i n D 1蛋白p 2 1蛋白p 2 7蛋白

表3 不同組別肝癌HepG 2細胞遷移、侵襲數目及MMP相關蛋白表達水平的比較（± s）

表3 不同組別肝癌HepG 2細胞遷移、侵襲數目及MMP相關蛋白表達水平的比較（± s）

組別a n t i‐m i R N A‐N C組a n t i‐m i R N A‐5 7 4‐5 p組t值P值6 8.4 2±6.3 5 3 1.4 8±3.2 7 1 2.6 6 8＜0.0 1 5 9.6 1±5.3 7 2 7.2 4±3.6 8 1 2.1 8 0＜0.0 1 0.5 9±0.0 5 0.1 8±0.0 3 1 7.2 2 3＜0.0 1 0.6 7±0.0 6 0.2 8±0.0 3 1 4.2 4 1＜0.0 1 0.6 3±0.0 6 0.2 1±0.0 2 1 6.2 6 7＜0.0 1遷移細胞數目 侵襲細胞數目M M P 2蛋白M M P 9蛋白M M P 1 4蛋白

表4 不同組別肝癌HepG 2細胞增殖、遷移、侵襲情況及cyclin D 1、 p21、MMP 2、MMP 9蛋白表達水平的比較（± s）

表4 不同組別肝癌HepG 2細胞增殖、遷移、侵襲情況及cyclin D 1、 p21、MMP 2、MMP 9蛋白表達水平的比較（± s）

組別pcDNA組pcDNA‐HTRA1組t值P值增殖率（%）24 h 56.34±5.02 50.63±5.02 0.490＞0.05 48 h 67.25±6.24 39.41±3.22 4.271＜0.01 72 h 76.24±7.03 32.46±2.07 9.453＜0.01遷移細胞數目72.46±7.38 39.52±3.55 9.853＜0.01侵襲細胞數目62.41±6.28 35.44±4.18 8.757＜0.01 cyclin D1蛋白0.65±0.06 0.32±0.03 12.050＜0.01 p21蛋白0.28±0.03 0.68±0.07 12.865＜0.01 MMP2蛋白0.61±0.06 0.22±0.03 14.241＜0.01 MMP9蛋白0.69±0.07 0.36±0.03 10.614＜0.01

圖1 HTRA 1的 3'UTR和miRNA‐574‐ 5 p序列

3 討論

肝癌的高復發率和高轉移率嚴重影響患者的生存情況，目前多采用手術、放療、化療的方法進行治療[7]。但是目前的治療技術仍無法有效防治肝癌的復發、轉移，因此，本研究以研究肝癌細胞增殖、轉移、侵襲的分子機制為突破口，尋找靶向治療分子，探究靶向治療對肝癌防治的意義。

miRNA是一類內源性非編碼小分子RNA，隨著對miRNA研究的深入，研究證實，miRNA的失調在包括惡性腫瘤、炎癥性疾病等在內的多種疾病中發揮重要作用[8]。目前，以miRNA模擬物及siRNA為靶向分子治療的方案備受醫學界青睞。miRNA‐574‐5p已被證實在腫瘤的侵襲和轉移中發揮重要作用，乳腺癌患者血清中的miRNA‐574‐5p水平明顯高于良性乳腺病變患者及健康人群，且miRNA‐574‐5p水平與乳腺癌患者的臨床特征及預后密切相關[2,9]；miRNA‐574‐5p在宮頸癌組織中高表達，抑制miRNA‐574‐5p的表達可使宮頸癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力均明顯下降[10]。研究顯示，敲除miRNA‐574‐5p表達能夠抑制甲狀腺癌細胞的增殖，促進細胞凋亡[4,11]。本研究結果顯示，肝癌細胞中miRNA‐574‐5p的表達水平明顯高于正常肝細胞；進一步驗證miRNA‐574‐5p對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，結果發現，抑制miRNA‐574‐5p的表達后，細胞的增殖率明顯下降，遷移和侵襲數目均明顯降低，p21、p27蛋白的表達水平均明顯升高，cyclin D1、MMP2、MMP9、MMP14蛋白的表達水平亦均明顯降低，與上述研究結果一致，提示抑制miRNA‐574‐5p的表達可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

HTRA1是第一個被發現的同源性的不同結構域的絲氨酸蛋白酶家族成員[12]，被證實作為腫瘤抑制因子表達于多種腫瘤中，但其在腫瘤組織中隨著惡性程度的升高呈下調性表達[13‐15]。HTRA1在浸潤性宮頸癌組織中的表達水平低于原位癌，抑制宮頸癌細胞增殖的作用減弱[16]。HTRA1在胰腺癌組織中的表達水平明顯降低，通過調控Notch‐1促進胰腺癌細胞凋亡，抑制胰腺癌細胞遷移[17]。HTRA1表達的下調與乳腺癌患者的不良預后有關[18]。HTRA1在腦膜瘤、肝癌組織中的表達水平均明顯低于正常組織，抑制其表達可增強細胞的遷移和侵襲能力[19‐20]。本研究結果顯示，HTRA1在肝癌細胞中的表達水平明顯低于正常肝細胞；進一步驗證HTRA1對HepG2細胞增殖、遷移和侵襲的影響，結果發現，過表達HTRA1的HepG2細胞的增殖率、遷移和侵襲數目及cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白的表達水平均明顯降低，p21蛋白的表達水平明顯升高，與上述研究結果一致，提示過表達HTRA1可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

Target Scan軟件預測結果顯示，miRNA‐574‐5p與HTRA1的3'UTR區域存在潛在結合位點，雙熒光素酶報告實驗顯示，僅 miRNA‐574‐5p+WT‐HTRA1組HepG2細胞中miRNA‐574‐5p的表達水平明顯降低，提示miRNA‐574‐5p可通過直接與HTRA1的3'UTR區域結合抑制HTRA1的表達；進一步驗證miRNA‐574‐5p與HTRA1在肝癌發展中的作用，結果發現，過表達miRNA‐574‐5p的HepG‐2細胞中HTRA1蛋白的表達水平明顯下降，抑制miRNA‐574‐5p表達的HepG‐2細胞中HTRA1蛋白的表達水平明顯升高，提示miRNA‐574‐5p可靶向負調控HTRA1的表達；進一步研究miRNA‐574‐5p靶向HTRA1對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響，結果顯示，與 anti‐miRNA‐574‐5p+si‐NC組比較，an‐ti‐miRNA‐574‐5p+si‐HTRA1組肝癌細胞的增殖率、遷移細胞數目、侵襲細胞數目，以及cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白的表達水平均明顯升高，p21蛋白的表達水平明顯降低，提示抑制HTRA1表達可逆轉抑制miRNA‐574‐5p表達引起的HepG2細胞增殖抑制及遷移、侵襲細胞數減少的作用，提示miRNA‐574‐5p可靶向HTRA1調控肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

表5 抑制HTRA 1表達逆轉抑制miRNA‐574‐ 5 p表達對肝癌HepG 2細胞增殖、遷移、侵襲的作用（± s）

表5 抑制HTRA 1表達逆轉抑制miRNA‐574‐ 5 p表達對肝癌HepG 2細胞增殖、遷移、侵襲的作用（± s）

注：a與anti‐miRNA‐NC組比較，P＜0.05；b與anti‐miRNA‐574‐5p+si‐NC組比較，P＜0.05

組別a n t i‐m i R N A‐N C組a n t i‐m i R N A‐5 7 4‐5 p組a n t i‐m i R N A‐5 7 4‐5 p+s i‐N C組a n t i‐m i R N A‐5 7 4‐5 p+s i‐H T R A 1組F值P值5 5.3 2±5.3 5 5 1.2 3±5.0 2 4 8.2 6±4.2 8 5 2.6 1±5.2 8 1.8 6 1＞0.0 5 6 8.2 5±6.0 7 3 8.6 5±3.2 8 a 3 7.9 1±3.0 7 5 9.6 2±5.0 7 b 8 0.2 7 4＜0.0 1 7 6.9 8±7.0 2 3 1.5 2±3.2 8 a 2 9.6 5±2.7 7 6 5.4 2±6.0 7 b 1 6 4.6 4 0＜0.0 1 7 3.5 2±7.3 2 3 2.4 9±3.7 1 a 2 8.5 4±3.5 1 5 9.6 7±5.3 4 b 2 0 7.8 6 8＜0.0 1 6 2.3 8±6.1 6 2 4.3 1±3.0 5 a 2 1.9 7±3.4 8 4 8.6 8±4.3 9 b 2 3 3.1 3 0＜0.0 1 0.6 4±0.0 6 0.2 5±0.0 3 a 0.2 2±0.0 3 0.5 1±0.0 5 b 2 5 2.1 5 2＜0.0 1 0.3 0±0.0 3 0.7 3±0.0 7 a 0.7 6±0.0 7 0.4 9±0.0 5 b 1 7 0.9 0 9＜0.0 1 0.6 1±0.0 6 0.2 1±0.0 3 a 0.1 9±0.0 2 0.4 7±0.0 4 b 3 0 9.1 6 9＜0.0 1 0.6 8±0.0 7 0.2 9±0.0 3 a 0.2 7±0.0 2 0.5 5±0.0 5 b 2 2 2.2 9 9＜0.0 1增殖率（%）2 4 h 4 8 h 7 2 h遷移細胞數目侵襲細胞數目c y c l i n D 1蛋白p 2 1蛋白M M P 2蛋白M M P 9蛋白

綜上所述，本研究初步探討了miRNA‐574‐5p在肝癌中的作用及機制，驗證了miRNA‐574‐5p靶向調控HTRA1的表達對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響，為肝癌的分子靶向治療提供理論依據。本研究尚存在不足之處，關于miRNA‐574‐5p和HTRA1靶向調控通路有待進一步深入研究。