交聯透明質酸鈉微生物限度檢查方法驗證

徐雯 曹弋 吳劍英

摘 要 目的：建立合適的交聯透明質酸鈉微生物限度檢查方法及控制菌檢查方法，并進行方法學驗證研究。方法：在前期摸索的提高稀釋倍數方法的基礎上，依據《中國藥典》2015版采用濾紙過濾加薄膜過濾法對交聯透明質酸鈉進行微生物限度檢測。結果：需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數檢查試驗中5種測試菌的回收率均在0.5～2.0之間，符合規定。結論：該檢查方法操作方便，結果準確可靠，適用于交聯透明質酸鈉的微生物限度檢測。

關鍵詞 交聯透明質酸鈉 微生物限度 薄膜過濾法

中圖分類號：R917 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2020）13-0070-03

Validation of microbial limit test method for cross-linked sodium hyaluronate

XU Wen1*， CAO Yi1， WU Jianying2**

（1. Shanghai Jianhua Fine Biological Products Co.， Ltd.， Shanghai 200231， China； 2. Shanghai Haohai Biological Technology Co.， Ltd.， Shanghai 201613， China）

ABSTRACT Objective： To establish a microbial limit detection method for cross-linked sodium hyaluronate and verify the methodology to ensure its applicability. Methods： According to the 2015 edition of the Chinese Pharmacopoeia， the total number of aerobic bacteria， molds and yeasts in cross-linked sodium hyaluronate was tested by membrane filtration method. Results： The recovery rates of the five test microoganims were in the range of 0.5 to 2.0， which were in compliance with the regulations. Conclusion： The method is accurate， reliable， easy to be operated and suitable for the detection of microbial limit of cross-linked sodium hyaluronate.

KEy WORDS cross-linked sodium hyaluronate； microbial limit； membrane filtration method

透明質酸是一種多功能基質，廣泛分布于人體各部位。其凝膠制劑廣泛應用于眼科黏彈性保護劑、骨科功能改善劑、外科防粘連保護劑、組織填充劑（如整形外科）等領域，在臨床已應用十多年，其安全性及有效性得到了醫學各界普遍認可[1-2]。天然透明質酸鈉用于關節腔注射治療骨關節炎（OA）患者時，其在體內半衰期僅為1～2 d，關節腔存留時間過短限制了其作用的發揮。利用其分子中的羥基、羧基、Ⅳ-乙酰氨基和還原末端與不同的交聯劑反應可得到不同類型的交聯透明質酸鈉凝膠產品，不僅可以保留原有的生物相容性、細胞黏附能力，而且具有更好的流變性能，機械強度和較高穩定性，延長其在體內的存留時間[3]。

在交聯透明質酸鈉凝膠產品的開發過程中，通過透明質酸鈉干粉和交聯劑進行交聯反應后制備得到交聯透明質酸鈉凝膠中間品，在成為最終產品前應對中間品的微生物污染狀況進行控制。但是由于交聯透明質酸鈉凝膠中間品為較透明質酸鈉自身更高黏度的顆粒凝膠，而且產品使用交聯劑進行反應后其組成成分較復雜，因此交聯后的透明質酸鈉的微生物限度的檢測方法應與其原料檢測方法有所不同，其微生物限度的檢測具有一定的難度[4-5]。筆者在前期研究中，通過采用提高稀釋倍數加薄膜過濾法，初步摸索了產品的稀釋倍數，但是試驗結果中交聯劑輔料和菌落混淆，影響平板觀察，因此本研究進一步改進試驗方法，采用一定的稀釋倍數，并通過定性濾紙過濾加薄膜過濾法，驗證該方法適用于交聯透明質酸鈉微生物限度的檢測。

1 材料和方法

1.1 菌株與培養基

金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、銅綠假單胞菌、白色假絲酵母、黑曲霉和大腸埃希菌6種菌株均購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：191024、190822、191112、191031、191010、191022。

胰酪大豆胨瓊脂TSA、沙氏葡萄糖瓊脂SDA、胰酪大豆胨液體TSB，批號分別為20180123、20180102、20190226，均來自北京三藥科技開發有限公司并經過適用性檢查，符合要求。

1.2 試樣與試劑

交聯透明質酸鈉凝膠中間品（批號1912271，上海建華精細生物制品有限公司自制），pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（以下簡稱為緩沖液）按照中國藥典2015版四部通則配制[6]。

1.3 儀器

SPX-250B-Z型生化培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；YXQ-SG46-280S型滅菌鍋（浙江新豐醫療器械有限公司）；PL2002型天平（Mettler Toledo）。一次性微孔濾膜（孔徑：0.45 mm；批號：191028；上海興亞凈化材料廠）。

1.4 方法

參照中國藥典2015版四部通則1105和1106[6]進行試驗。

1.4.1 供試品和菌液的制備

取交聯透明質酸鈉凝膠中間品1 g加入緩沖液100 ml，產品黏度高，應充分振搖至完全溶解，再經已滅菌的定性濾紙過濾后收集溶液即為供試品。6種定量菌株均按說明書加入復溶溶液1.0 ml后完全溶解即為測試菌。

1.4.2 需氧菌總數計數方法的驗證

取一批供試品用需氧菌進行測試，重復操作3次。①測試組：取100 ml供試品和0.1 ml的測試菌菌懸液（不超過100 cfu）混合，用薄膜過濾法進行測試。沖洗溶液為300 ml緩沖液，每次用100 ml沖洗3次，將濾膜粘貼在裝有TSA培養基的平皿中，置于30～35 ℃倒置培養。②菌液對照組：取100 ml緩沖液加入測試菌，進行回收率試驗。③供試品對照組：不加入測試菌，測定供試品微生物數量。

1.4.3 真菌總數計數方法的驗證

以白色假絲酵母和黑曲霉為測試菌按1.4.2同法操作，置于裝有SDA培養基的平皿中，置于20～25 ℃倒置培養。

1.4.4 計算公式及可接受標準

測試組菌數回收率=（測試組菌落數-供試品對照組菌落數）/菌液對照組菌落數，均在0.5～2.0的范圍內。

1.4.5 控制菌檢查法的驗證

以大腸埃希菌為測試菌按1.4.2同法操作，置于TSB中進行培養。

2 結果

2.1 需氧菌總數計數方法的驗證

交聯透明質酸鈉凝膠供試品進行平行3次驗證試驗結果見表1，供試品對照組中3種測試菌株菌落數均為0，試驗中3種測試菌回收率均在0.90～1.10之間，符合可接受標準，表明方法適用。

2.2 真菌總數計數方法的驗證

采用一批供試品進行平行三次驗證試驗結果見表2，供試品對照組中2種測試菌株菌落數均為0，試驗中2種測試菌回收率均在0.90～1.10之間，符合可接受標準，表明方法適用。

2.3 控制菌檢查法的驗證

采用一批供試品進行平行三次驗證試驗結果見表3，結果表明適用性試驗符合要求。

3 討論

交聯透明質酸鈉凝膠產品為一種無色透明的凝膠溶液，其黏度高達200 Pa·s以上，在微生物限度檢測中需消除其高黏度對檢測的影響，而本產品中含有交聯劑輔料也會影響微生物限度的檢測。本次研究前期通過查閱相關參考文獻[7-10]，摒棄了透明質酸微生物限度檢查中采用酶降解后進行加熱溶脹的預處理方式，將交聯透明質酸鈉供試品進行一定的稀釋，消除了產品高黏度對檢測的影響，操作簡便。前期研究中選擇pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋液，稀釋倍數為100倍，可保證溶液混合均勻，使得在采用薄膜過濾法的過程中產品的過濾速度較快，消除產品的高黏度對檢測的影響，但是僅對產品進行稀釋的試驗結果發現供試品對照組及測試組培養皿生長的菌落混濁，導致無法對菌落進行計數。因此在本研究中研究者繼續摸索了去除輔料干擾的預處理方式，在前期研究確定稀釋倍數的基礎上再通過定性濾紙過濾的方法處理交聯透明質酸鈉凝膠，并采用薄膜過濾法消除產品中交聯劑輔料的干擾。

本研究表明，采用上述預處理方式進行交聯透明質酸鈉微生物限度檢查符合中國藥典檢測微生物限度的有關要求。也許還有更適合的稀釋濃度可以消除產品高黏度對檢測的干擾，研究人員將繼續摸索以期發現更合適的稀釋倍數。

參考文獻

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