潰瘍性結腸炎活動期患者結腸鏡活檢腸道菌群分布及與其相關白細胞介素水平變化的關聯性

黃明靜

河南省息縣人民醫院，河南 信陽 464300

潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）屬于慢性結腸炎性疾病，目前普遍認為其病因、發病機制與免疫功能異常、遺傳易感因素、環境因素等多種因素間相互作用有關［1］。免疫應答紊亂、慢性炎性反應是導致UC關鍵病理環節，而導致炎性反應、免疫應答改變重要因素為腸道內菌群紊亂［2］。目前，針對UC患者腸道內菌群研究因選取疾病病程和分期不同、治療與否所致分析方法不同，加之腸道內菌群復雜性，其完整結構、功能并未被完全了解，進而導致對腸道內需氧菌、常見厭氧菌變化認知不統一，也未能完全闡明其在疾病發生中具體作用［3］。本研究利用涂片鏡檢、免疫組化、細菌培養、real-time PCR等對UC活動患者、健康體檢者的菌群進行分析，并將IL-23、IL-17與目標菌群相關性進行分析。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取河南省息縣人民醫院于2018年3月—2019年9月間UC活動期患者56例為研究組，選同期健康體檢者63例作為對照組。研究組，男性27例，女性29例，年齡25～71歲，平均年齡（48.03±11.46）歲，病程1～15年，平均病程（8.01±3.47）年；對照組，男性30例，女性33例，年齡25～72歲，平均年齡（48.47±11.73）歲，均已簽署知情同意書。兩組一般資料（年齡、性別）差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審核同意。

1.2 納入標準及排除標準

（1）納入標準：患者均符合《潰瘍性結腸炎中西醫結

合診療共識意見（2017年）》［4］中關于活動期UC診斷標準者；臨床資料完整者。（2）排除標準：合并心、肺、腎、肝等嚴重疾病者；伴有糖尿病嚴重者；伴有嚴重感染者；伴有UC并發癥者；哺乳期、妊娠期女性；伴有腸外表現者；伴有其他自身免疫疾病者。

1.3 方法

1.3.1 涂片鏡檢：取新鮮糞便標本，2 h常規涂片，干燥固定后予以革蘭染色，于油鏡下對10個視野進行觀察，依據油鏡視野內細菌綜合素質、細菌比例，確認是否發生菌群失調和失調程度。

1.3.2 細菌培養鑒定：采用10μl接種環對新鮮糞便進行挑取，利用4區劃線法接種。（1）厭氧培養：于厭氧血平板上進行接種，于37℃的無氧環境中孵育48 h，取優勢菌行耐氧實驗，利用API20A厭氧菌鑒定卡對專性厭氧菌鑒定；（2）需氧培養：于血平板、中國藍平板上進行接種，在濃度為5%CO2、37℃的有氧環境中進行24 h孵育，采用全自動細菌鑒定儀對優勢菌的菌種進行鑒定；（3）選擇性培養基：接種擬桿菌、大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌選擇性培養基培養。

1.3.3 real-time PCR熒光定量分析：將涂片、培養剩余標本置于-80℃保存，利用糞便DNA組提取試劑盒抽提糞便總DNA，測定其DNA濃度后，保存至-20℃；利用real-time PCR試劑盒擴增糞便DNA，將每個標本行復孔檢測。

1.3.4 免疫組化法對結腸組織中的IL-23、IL-17表達進行檢測：切片脫蠟直至水化，采用3%H2O2將內源性過氧化物酶進行阻斷，采用微波將抗原修復，分別和IL-17、IL-23Ⅰ抗在4℃下孵育過夜，將辣根過氧化物酶、Ⅱ抗對鏈霉卵白素工作液進行標記，DAB進行顯色，其中棕褐色的反應產物為抗原定位。

1.3.5 Baron分級、結腸組織病理學分析：（1）Mayo評分：評價疾病活動度，癥狀減輕為＜2分，輕度活動期3～5分，中度活動期為6～10分，中度活動期為11～12分；（2）內鏡下活動度分級：依據改良Baron分級；（3）結腸組織病理學評分：對腸黏膜組織行常規石蠟切片，并予以HE染色，與光鏡下對腸黏膜潰瘍形成、炎性細胞浸潤、水腫、充血等狀況進行觀察，依據Siegmund等評分法進行評分。每個標本取5張切片，每個切片隨機選4個視野。

1.4 觀察指標

（1）鏡檢、細菌培養鑒定、real-time PCR的熒光定量分析。（2）IL-17、IL-23表達和Baron分級、結腸組織病理學評分相關性分析。（3）IL-17、IL-23表達和菌群熒光定量相關性分析。

1.5 統計學方法

數據采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s)表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用例數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，并行Spearman相關分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組鏡檢、細菌培養、real-time PCR的熒光定量結果

與對照組對比，研究組球菌數量上升，桿菌數量降低，且菌群失調度升高，Ⅱ度、Ⅲ度失調比例由對照組10%、0升至研究組的30%、25%；厭氧菌、需氧菌均有改變，其中厭氧菌總數減少，主要表現在擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌減少，需氧菌總數上升，表現在大腸桿菌減少、腸球菌升高。

2.2 IL-17、IL-23表達和Baron分級、結腸組織病理學評分相關性

經Spearman分析，IL-23、IL-17與Baron分級（r23=0.850，r17=0.718）、結腸組織病理學評分（r23=0.676，r17=0.659）呈正相關（P＜0.05），見表1。

表1 IL-17、IL-23表達和Baron分級、結腸組織病理學評分相關性

2.3 IL-17、IL-23表達和菌群熒光定量相關性分析

經Spearman分析，IL-23與大腸桿菌數呈負相關（r=-0.701）、與腸球菌數呈正相關（r=0.873），IL-17與腸球菌數呈正相關（r=0.765，P＜0.05），見表2。

表2 IL-17、IL-23表達和菌群熒光定量相關性分析

3 討論

腸道菌群可構成復雜的腸道微生態系統，在機體腸道免疫系統、抑制致病菌、營養位置吸收合成等方面具有重要作用［5］。研究認為，UC發病原因為腸黏膜的屏障功能產生異常，腸道內菌群紊亂、異常免疫反應介導間互相作用，導致腸黏膜功能出現異常，其參與UC發病。目前發現多種類病毒、細菌等參與炎性腸病發病［6］。基于分析方法不同，UC活動期腸道菌群構成研究結果不同。

本研究對各組標本予以糞便涂片、厭氧和需氧菌培養，結果顯示，厭氧菌、需氧菌均有改變，其中厭氧菌總數減少，主要表現在擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌減少，需氧菌總數上升，表現在大腸桿菌減少、腸球菌升高。這一結果與王艷等［7］研究結果類似，大致揭示在UC活動期內腸道菌群分布狀況。正常狀況下，乳酸桿菌、雙歧桿菌和腸黏膜細胞可密切結合，于腸黏膜表面生成生物學屏障，進而阻止致病菌的入侵，而二者減少可降低腸黏膜防御功能。腸球菌可釋放外毒素，進而加重已存在的免疫紊亂和炎性反應，但具體作用機制仍需進一步研究。本研究結果顯示，經Spearman分析，IL-23、IL-17與Baron分級、病理學組織評分呈正相關，且IL-23與大腸桿菌數呈負相關、與腸球菌數呈正相關，IL-17與腸球菌數呈正相關，說明IL-17、IL-23在UC活動期發生、發展均具有關鍵性作用。最新研究顯示，以分泌IL-17為特征CD4+T細胞屬于新型輔助T淋巴細胞亞群，其具有介導免疫性疾病、炎性反應等免疫調節重要作用［8］。腸道內的致病菌產物和各自Toll樣受體發生結合，可誘導抗原細胞分泌IL-23，而IL-23和相應受體相結合，繼而誘導IL-17表達，進而促進炎性級聯放大，從而介導腸道炎性反應、腸黏膜損傷。本研究具有一定局限性，細菌培養僅能檢測腸道內活菌，無法代表死菌，且腸道內菌群種類繁多，無法反映所有菌群，且在分析過程中僅涉及現有條件下具有代表性菌種。

綜上所述，UC活動期患者具有明顯菌群失衡，且菌群改變與疾病炎性程度具有密切聯系，IL-23、IL-17與腸道內菌群含量變化具有較強的關聯性，在UC發生中起重要作用，屬于UC關鍵因子。