一種利用流式細胞儀快速檢測植物倍性的分析方法

董馨憶

（昆明醫科大學科研實驗中心，云南 昆明 650000）

在研究植物的過程中，往往要對其生長發育和基因等因素進行檢測研究，其中，對植物的基因組大小以及其DNA倍性的研究對該植物的品系、性狀及營養和藥用價值等都有著極其密切的關聯。特別是在植物遺傳育種中，植物染色體倍性鑒定是不可缺少的步驟，有效的倍性鑒定是了解其遺傳背景和進一步應用的基礎。在植物研究中，檢測植物的基因組大小和DNA倍性是有非常重要意義的。

除細菌和藍藻的細胞以外，所有的動物細胞以及植物細胞都屬于真核細胞。研究表明包括植物細胞在內的真核生物的細胞增殖主要都是通過有絲分裂的方式。我們首先要知道，細胞有絲分裂的一個循環被稱為細胞周期，它指細胞從上一次分裂結束到下一次分裂結束所完成的活動過程。整個周期被人為的分為：有絲分裂期（M）、有絲分裂后間期（G1）、DNA合成期（S）和合成后間期（G2）[1]。另外，除了有絲分裂這個增殖的周期之外，在許多雙子葉植物的發育過程中，組織細胞也會受到一些其他的發育信號以及環境因素的影響，在S期完成后會直接重新回到Gl期開始新一輪的DNA復制，這個過程是跳過了G2和M期的，經過如此特殊的一個循環，就可以促使植物形成多倍體細胞，而在植物育種過程研究中，多倍體育種是特別重要的途徑之一，它不僅可以對植物的性狀進行改良，還可以提高植物體內各種有效成分的含量。這種特殊的導致多倍體形成的細胞周期在雙子葉植物的葉、下胚軸、花器官和果實等器官的發育過程中是普遍存在的，而且這還與該植物細胞的擴展、分化密切相關。

正是因為對植物倍性的有效鑒定是了解其遺傳背景和進一步研究的基礎，所以我們才要找到并利用有效且快速的倍性鑒定方法，才能夠準確地辨認多倍體并將其挑選出來。

流式細胞儀（Flow cy tometry ，簡稱FCM，是一種可以對動植物細胞或者一些微粒進行自動分析和分選的儀器。該儀器運用了激光技術和光電測量技術，并將計算機技術和流體力學結合起來，以細胞免疫熒光化學技術為基礎，逐漸發展成為現代分子生物學實驗室不可或缺的高科技細胞分析技術。由于流式細胞儀在檢測細胞的大小、內部結構、DNA含量、特異蛋白質含量以及表面抗原等參數的優勢，所以其現在也已廣泛應用在植物遺傳學，植物生理學等多個領域[2]。本實驗旨在尋求植物DNA倍性分析的高效快速的一個檢測方法。如果操作得當，那么流式細胞儀完全可以可在半小時內完成樣本制備及染色并檢測植物DNA倍性的全過程，如此方便快捷的方法，應該是值得推廣應用的。

流式細胞儀檢測植物倍性，主要以檢測其DNA含量為基礎。在檢測植物細胞的周期實驗中，G1期的細胞為二倍體，其DNA含量我們將其表示為2D（這里我們用“D”表示單倍體核的DNA含量），在S期DNA完成復制之后后，細胞就會變為四倍體，此時DNA含量為4D。植物細胞與動物細胞不同，在許多植物器官生長發育過程中，很多時候都是經歷了跳過G2和M期的特殊循環，這樣特殊的方式伴隨細胞的擴展和分化，細胞由有絲分裂進入內復制，就會使植物細胞的倍性呈指數的增長，不僅僅只有2D、4D，甚至是會增加至8D、16D，乃至到32D或者更高，在二倍體與四倍體區域以外的統稱異倍體[3]。利用分析型流式細胞儀，就可以精確地測定細胞內DNA的含量，以此快速準確的判斷其倍性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗中使用的流式細胞儀是德國partec，其型號是CyFlow? Space，DAPI熒光染料也同樣購自德國partec。4，6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI），是一種標記細胞DNA的染料，可以非嵌入方式與DNA鏈上的A-T堿基對特異性結合。DAPI與雙鏈DNA結合時，熒光強度增強200倍，而與單鏈DNA結合時無熒光增強，與RNA結合不會形成強熒光，明顯弱于DNA[4]，染色前無需用RNase處理細胞。

1.2 樣品的采集、保存和處理

試驗中所用的植物為馬鈴薯嫩葉，已經過前期處理。并對新鮮樣品的保存條件、保存時間、制取方法等進行了摸索和優化。

加入DPAI熒光染料之前一定要用過濾網（至少300目）過濾，不少于2遍。留取至少1mL濾液備用。將濾液放入離心機，室溫下離心5min，1500rpm。棄上清，加入1mL超純水混勻，室溫下離心5min，1500rpm，棄上清，備用。

1.3 樣品的染色

每管樣品中加入1mLDAPI，充分混勻。上樣前再次過濾，300目。將制備好的細胞懸液充分混勻，轉至3.5mL專用流式管中，備用。

1.4 上機檢測

開機，根據DAPI染料，選擇使用UV激發光。調整好對應的接收通道、合適的進樣速度之后，將染色好的樣品逐一檢測。

樣品檢測之前要以每種植物的已知二倍體為對照，以它為標準，給待測樣本DNA的含量提供一個對照。對照樣本的所有處理過程要以其他樣品一致。

調節FL9通道的電壓值，將已知二倍體樣品的熒光峰即G1期峰調至熒光道數為100處，收集信號，等到收集細胞數量達到20000后取下樣品，保持該電壓不動，逐一上樣，收集每管樣品細胞大約在10000～20000即可取下樣品，記錄該樣品DNA峰型位置并將其保存好。測樣結束后用專用清洗劑清洗管道之后再用超純水清洗即可關機。

2 流式檢測植物倍性的參數設置

2.1 參數的選擇與調節

在德國partec CyFlow? Space型流式細胞儀所用的軟件界面， 根據DAPI染料的接收通道，選用第一張圖為FL9-A／FL9-W雙參數散點圖。橫軸為FL9-A，縱軸為FL9-W。這是一個采用了面積信號和寬度信號共同體現的散點圖，選用該散點圖是為了通過調節FL9-A和FL9-W的光電倍增管電壓，從該散點圖上選定目標細胞進行下一步的分析，如下圖（圖1）所示，圈起來的表示R1的這部分細胞即為我們所要分析的細胞，其余細胞碎片、雜質和一些黏連細胞就可以被不在分析的范圍內，這樣可以使結果更為準確可靠。

根據圖1中的R1細胞群，我們選擇使用第二張圖為橫坐標為FL9的單參數直方圖，如下圖（圖2）所示：在橫坐標的100和200的位置分別出現了兩個高尖峰，該圖為一個典型的二倍體。

3 結語

我們可以看到，利用流式細胞儀檢測植物細胞倍性的結果是十分明顯的，而且也比較可靠。經過流式細胞儀對大量的處于分裂間期的植物細胞DNA含量進行檢測，然后經其計算機軟件系統自動統計分析后形成的非常直觀的DNA含量的分布曲線圖，我們就能看到已知的二倍體、四倍體的峰型，然后穩定其檢測電壓不變，用已知樣本來比對位置樣本，在流式細胞儀極其快速的檢測過程中，一分鐘之內即可快速的得到每一個樣本的倍性，其結果穩定、直觀、可靠、快速，不失為一種有效地檢測方法，值得我們大力的推廣使用。而且該方法取材部位多種多樣，不僅僅可以是葉片，還可以是植物的根莖、花、果皮和種子等等，完全不受植物的取材部位和細胞所處時期限制，這點是優于其他檢測方法的，例如需要取根尖才能檢測的常規壓片法，必須取卷須的去壁低滲法等等。只是該方法一定要依靠一個專業的實驗室，配備相應的儀器，即使是一臺簡單的只有488激光器的最常規的流式細胞儀也比較昂貴，并且需要專業的儀器維護人員和專業熟練的操作才能得到真實可靠的結果，這也是制約了該技術發展的一個重要原因。筆者也希望在將來能夠將流式細胞儀技術更多的運用和發展，使之成為一項簡單且操作性強的儀器，使更多的實驗者了解和認知，才能更有力的推廣使用。