流式細胞儀檢測植物倍性的儀器參數(shù)設置體會

董馨憶，柏春玲，鄧菊慶，李璠，吳怡

（昆明醫(yī)科大學科研實驗中心，云南 昆明 650000）

流式細胞儀是一種全自動多色流式系統(tǒng)，兼具分析和分選雙相功能，并具有完整的多參數(shù)系統(tǒng)，能提供科研實驗室和臨床所必需的客觀、可重復的實驗結果[1]。流式細胞技術作為一門生物檢測技術已經(jīng)日臻完善，目前，該儀器已經(jīng)可以廣泛的應用于植物倍性的檢測實驗當中。

在植物倍性的檢測中，大量處理好的、處于分裂間期的植物細胞樣品經(jīng)過流式細胞儀對其中的DNA含量進行檢測之后，經(jīng)儀器自帶的計算機軟件系統(tǒng)自動統(tǒng)計分析后形成的非常直觀的DNA含量的分布曲線圖，我們就能看到該植物細胞樣品的峰值圖譜，再與已知的二倍體、四倍體的峰值圖譜比較之后，就能判斷出該樣品是屬于二倍體還是四倍體。

使用流式細胞術檢測植物細胞DNA含量，用于判斷其倍性的方法雖然是簡單有效，并且結果可靠，但是一定要特別注意檢測過程中，儀器參數(shù)的設置和調控。筆者長期從事流式細胞儀的管理工作，通過長期大量的實驗后，總結出一些經(jīng)驗教訓，謹以此文與大家分享交流。

1 儀器、材料與方法

1.1 實驗儀器

本實驗使用的是德國生產(chǎn)的Partec品牌流式細胞儀，其型號為 CyFlow? Space。德國Partec是全球三大流式細胞儀生產(chǎn)廠家之一，其產(chǎn)品遍布全球180多個國家和地區(qū)，該公司生產(chǎn)的流式細胞儀具有卓越的性能和優(yōu)良的品質。CyFlow? Space這個型號的流式細胞儀是該公司打造的新一代全能型流式細胞儀，有比較出眾的性能、也有靈活的配置空間以及方便快捷的操作。該儀器目前配備了3個激光光源，分別是488nm（激光器為Blue laser）、365nm（激光器為UV）、561nm（激光器為Yellow laser）、457nm（激光器為Dark Blue laser）、640nm（激光器為由軟件控制的Red laser），接收這些激光器的有FL-1至FL-13個光學通道，在具體的實驗中，實驗者只需要根據(jù)樣品所使用的熒光染料，找到的合適的激光器來和對應的接收通道，就可以實現(xiàn)大部分實驗的需求。

在本實驗中，我們根據(jù)檢測植物倍性的染料，選用的激光器是365nm也稱為UV（紫外）激光器，選用的對應接收通道為FL-9。

1.2 試劑

試驗中使用的DAPI熒光染料也同樣購自德國partec。DAPI熒光染料全稱為：4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚。這是一種標記可以用來做細胞DNA標記的染料。該染料的標記方式是以非嵌入方式與樣品DNA鏈上的A-T堿基對發(fā)生特異性的結合，當DAPI染料與樣品的雙鏈DNA結合時，DAPI的熒光強度可以增強，最大能夠增強200倍[2]。

1.3 樣品的制備

試驗中所用的植物為經(jīng)過前期處理好的馬鈴薯嫩葉，切碎后加入DPAI熒光染料，用過濾網(wǎng)（至少300目）過濾3遍。取濾液離心后棄上清，加入1mL超純水混勻，離心后棄上清，準備染色。在每管樣品中加入1mLDAPI，充分混勻。上樣前再次過濾，300目。將制備好的細胞懸液充分混勻，轉至3.5mL專用流式管中，備用。

2 流式檢測植物倍性的上機檢測

流式細胞儀打開UV激發(fā)光，調整好對應的接收通道FL-9，進樣速度調整至1，將染色好的樣品按照參照、樣品的順序逐一進行檢測。

3 結果與討論

3.1 坐標圖的選擇

在流式細胞儀結果圖中，我們可以自由的選擇橫坐標和縱坐標，但是一般情況下我們都要選擇的首先就是FSC與SSC的雙參數(shù)圖，該圖一般是用于目標細胞群的選擇。FSC與SSC均為流式細胞儀的散射光信號，前者被稱為前向角散射，后者被稱為側向角散射，這兩種散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術（例如染色的處理等等），因此被稱為細胞的物理參數(shù)或稱固有參數(shù)[3]。前向角散射與被測細胞的大小有關，側向角散射對細胞膜、質膜的折射率更為敏感，可提供有關細胞內精細結構和顆粒性質的信息。所以一般情況下，我們都會優(yōu)先選擇FSC/SSC雙參數(shù)的坐標圖來首先選取目標細胞[4][5]。

僅有一個FSC和SSC的坐標圖是不夠的，我們還要根據(jù)實驗所選用的染料來進行選用其他坐標圖。根據(jù)本實驗中DAPI染料的接收通道，選用橫坐標為FL-9的單參數(shù)直方圖。這是一個通過儀器的UV激光器激發(fā)了DAPI熒光染料，該染料發(fā)射出的光被儀器所接收到之后體現(xiàn)實驗結果的直方圖，該直方圖就是為了看到我們所需要的DNA含量。

3.2 對照的重要性

為了實驗的科學性和精密性，一般情況下我們都需要在實驗的過程中設置對照組，對照的目的是檢驗對比試驗的效果，沒有對照組，實驗組的實驗結果就將無法確定或者是無法判斷，所以在使用流式細胞儀對植物細胞的DNA含量進行檢測之前，首先要確定好每種樣品植物的已知二倍體作為整個實驗的對照。因為我們對樣品進行檢測得到的結果只是一個峰型圖，我們必須以對照，也就是已知的二倍體為參照，給樣本DNA的含量提供一個位置的對比，才能判斷出該樣品的倍性。

如上圖（圖1）所示：這是一個流式典型的單參數(shù)直方圖，橫坐標是植物細胞DNA含量，通道為FL-9，使用的是UV LED燈。這個圖為一個典型的二倍體圖，在圖中我們可以看到在橫坐標的100和200的位置分別出現(xiàn)了兩個峰，其中橫坐標100位置的這個峰高而且比較尖，其DNA含量我們設為N，而橫坐標200位置的這個峰稍短，其DNA含量相對對100這個位置的來說就應該是2N，所以說該樣品為二倍體。

3.3 參數(shù)調節(jié)的巧妙

在檢測過程中，值得注意的是要做好FL-9通道的電壓值的調節(jié)。在對照的檢查過程中，經(jīng)過幾次刷新后，結果的峰型圖已經(jīng)趨于穩(wěn)定，這個時候就要將已知二倍體的對照樣品的第一個高尖熒光峰調至橫坐標的熒光道數(shù)為100處，調好之后不斷刷新、觀察，使100這個位置可以正好處于該峰型的中間，然后保持電壓不變，收集足夠多的信號。為什么一定要將第一個峰調至橫坐標100的位置呢？這是為了更好地判斷其他峰的位置。只有第一個峰在橫坐標100的位置，才能比較直觀的得知橫坐標200位置的峰其DNA含量是其的2倍，也能比較直觀的得知橫坐標400位置的峰其DNA含量是其的4倍。如果不將第一個峰調整至橫坐標100的位置，那么我們在其他峰的判斷上面就更為不容易，可能需要仔細的、費時間的去數(shù)橫坐標的刻度，這些都不太直觀，耗時且還會發(fā)生判斷錯誤的情況。