桃仁承氣湯治療百草枯中毒肺損傷的實驗研究?

范興懇 鐘炳圖 陳學秀 徐曉微 柳會瓊 黃兆浪

（1.溫州醫科大學附屬蒼南醫院，浙江 溫州 325800；2.溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江溫州 325000）

百草枯（PQ）中毒以口服為主要途徑，是目前急診科最常見的中毒急危重癥。人口服PQ致死量為30～40 mg/kg，病死率可達50%～70%［1］之上。本研究為了探討桃仁承氣湯對PQ中毒引起的大鼠肺損傷的保護作用及機制，應用桃仁承氣湯治療大鼠PQ中毒肺損傷模型，觀察大鼠生存曲線和肺組織病理改變，檢測后細胞的氧化應激狀態、炎癥因子水平等變化，以期為桃仁承氣湯治療PQ中毒肺損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠80只。體質量200～250 g，由溫州醫科大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（浙）2018-103。本研究動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.2 藥物與試劑 桃仁承氣湯（大黃15 g，芒硝6 g，桃仁9 g，當歸9 g，白芍9 g，牡丹皮9 g，浙江宇晨中藥飲片有限公司）。PQ溶液（美國先正達）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、高遷移族蛋白（HMGB1）等ELISA檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.3 造模與給藥 實驗前8 h禁食、4 h禁水。按隨機數字表法分為空白對照組、桃仁承氣湯對照組、PQ模型組和桃仁承氣湯治療組，每組10只。灌胃染毒給藥：桃仁承氣湯治療組和PQ模型組予25%百草枯溶液灌胃染毒（100 mg/kg）；空白對照組灌胃0.9%氯化鈉注射液40 mL/kg。桃仁承氣湯治療組染毒后3、9、24、48 h予桃仁承氣湯灌胃（5.13 g/kg）；空白對照組和PQ模型組予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃；桃仁承氣湯對照組3、9、24、48 h予桃仁承氣湯灌胃。

1.4 觀察大鼠一般狀況及生存曲線 實驗從飼養開始至實驗結束，每小時觀察大鼠精神狀況、體表、活動、飲水進食情況，并密切觀察大鼠的二便情況；每半小時觀察各組大鼠死亡數，記錄染毒后72 h各組死亡數，計算各組大鼠存活率。

1.5 標本采集與檢測 1）血標本的檢測。實驗72 h后經股動脈采血，用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測大鼠血清TNF-α、IL-6、SOD、MDA、HMGB1的變化。2）肺干/濕重比（D/W）。采血后立即開胸取左肺精確稱重，烘烤至恒重，稱其干質量，計算D/W比值。3）肺組織病理學觀察。取部分右肺組織，行HE染色，光鏡下觀察肺組織病理變化，并進行病理評分；評分項目包括水腫、充血、中性粒細胞浸潤、支氣管內出血和碎屑、細胞增生，每項的評分按損傷程度分為0、1、2和3分，取5項評分總和。

1.6 統計學處理 應用SPSS23.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，生存曲線用Log Rank Test分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般狀況及存活率的比較 見表1。與空白對照組大鼠比較，PQ模型組大鼠一般狀況明顯變差；桃仁承氣湯治療組除大便次數多、軟，一般狀況較PQ模型組好轉。PQ模型組大鼠中毒后72 h存活率為60%，桃仁承氣湯治療組同時間點存活率為90%，兩組間差異具有統計學意義（P<0.05）?？瞻讓φ战M及桃仁承氣湯對照組大鼠存活率均為100%。

表1 各組大鼠存活率比較（n）

2.2 各組大鼠肺D/W和病理學指標的比較 見表2。與空白對照組比較，PQ模型組肺D/W明顯下降（P<0.05）；與PQ模型組比較，桃仁承氣湯治療組肺D/W值顯著下降（P<0.05）。病理組織評分：與空白對照組比較，PQ模型組大鼠肺病理組織評分明顯升高（P<0.05）；與PQ模型組比較，桃仁承氣湯治療組大鼠的肺病理組織評分下降（P<0.05）。

表2 各組大鼠肺組織干濕重比和病理學評分比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織干濕重比和病理學評分比較（±s）

與空白對照組比較，?P<0.05

組 別 肺病理學評分（分）n 肺D/W空白對照組桃仁承氣湯對照組PQ模型組桃仁承氣湯治療組0.750±0.463 0.875±0.344 14.87±0.354*12.75±1.389△10 10 10 10 0.228±0.004 0.225±0.009 0.206±0.011*0.164±0.005△

2.3 各組光鏡下大鼠肺組織病理學比較 見圖1。光鏡下空白對照組和桃仁承氣湯對照組的肺臟組織結構完整，肺泡間隔無水腫、炎癥，肺泡腔清晰，PQ模型組大鼠大部分肺泡腔內可見滲出、水腫、出血，肺間質有大量炎性細胞浸潤，而桃仁承氣湯治療組大鼠上述病變減輕。

2.4 各組炎癥因子水平比較 見表3。與空白對照組比較，PQ模型組TNF-α、IL-6水平明顯升高，桃仁承氣湯治療組大鼠TNF-α、IL-6水平則較PQ模型組明顯下降（P<0.05）。與空白對照組比較，PQ模型組HMGB1水平明顯升高，而桃仁承氣湯治療組大鼠HMGB1水平則較PQ模型組明顯下降（P<0.05）。

圖1 各組光鏡下大鼠肺組織病理學表現（HE染色，200倍）

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平比較（pg/mL，±s）

組別空白對照組桃仁承氣湯對照組PQ模型組桃仁承氣湯治療組n 10 10 10 10 TNF-α 21.43±1.902 23.66±4.171 27.35±3.462*21.42±4.475△IL-6 61.56±9.469 73.12±17.82 140.3±27.46*113.2±16.39△HMGB1 14.76±1.363 17.98±2.634 33.21±6.611*25.41±7.097△

2.5 各組氧化應激因子水平比較 見表4。與空白對照組比較，PQ模型組SOD水平明顯下降，MDA明顯升高（P<0.05）；與PQ模型組比較，桃仁承氣湯治療組大鼠SOD水平明顯升高，MDA水平明顯下降（P<0.05）。

表4 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較（±s）

表4 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較（±s）

組別空白對照組桃仁承氣湯對照組PQ模型組桃仁承氣湯治療組n 10 10 10 10 SOD（ng/mL）1.200±0.0088 1.324±0.1594 0.667±0.1819*1.233±0.3307△MDA（nmol/mL）0.3973±0.0784 0.4321±0.1423 0.6677±0.1598*0.3612±0.1682△

3 討 論

PQ致死率高，發病機制復雜，救治困難。目前臨床上對PQ中毒導致的損傷治療并無特異的治療藥物［2-3］。本團隊研究一系列在實驗動物體內能降低PQ中毒的藥物如：Betanin［4］、二巰丙磺鈉［5］、血必凈注射液［6］、烏司他丁［7］等，這些藥物大多減輕動物體內氧化損傷、降低炎癥因子水平，可改善受損臟器的功能，但臨床上效果不理想。因此，尋找能提高PQ急性中毒解毒療效藥物，降低死亡率具有重大的意義。中醫藥治療PQ中毒肺損傷方面的文獻記載較少，尤其是經方。桃仁承氣湯見載于《溫病條辨》。《溫病條辨·下焦篇》第21條云“少腹堅滿，小便自利，夜熱早涼，大便閉，脈沉實者，蓄血也。桃仁承氣湯主之”。本方由大黃、芒硝、桃仁、當歸、白芍、牡丹皮組成，功擅瀉熱通腑，活血化瘀。有文獻報道，桃仁承氣湯能升高ALI/ARDS大鼠SOD水平，降低TNF-α、白細胞介素-1β（IL-1β）等水平，并且減輕肺間質及肺泡炎性細胞的浸潤、滲出和積聚，改善肺水腫與肺瘀血，有一定的肺保護作用［8-9］。

PQ致肺損傷在臨床上主要表現為咳嗽、喘憋、胸悶、呼吸頻率加快（氣促），甚至口唇發紺，多伴有腸鳴音減弱、腹脹便秘等。其基本的病理特點在于肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞廣泛受損，血管通透性增強引起肺間質和肺泡水腫，肺內開放的血管減少形成微血栓，導致肺內微循環障礙。中醫文獻中雖無此類病的記載，但根據其臨床所表現的呼吸窘迫、口唇發紺、腹部脹滿、大便秘結等特點，可將之歸于“暴喘”“喘脫”和“腑實”“結胸”等范疇［10］，晚期屬于“肺痿”范疇。早期本病病機多屬邪毒內滯腸胃，肺失宣降，肺氣上逆，氣滯血瘀；晚期本病病機多屬肺葉瘺廢，腎不納氣［11］。針對PQ肺損傷的病因及臨床表現，中醫學認為邪毒從口而入，雖經洗胃，但仍有PQ潴留胃腸，熱毒壅滯，肺與腸相表里，腸病及肺，肺腸同病，故中醫學從整體觀念的理論出發，認為“肺與大腸相表里”是PQ肺損傷發病機制之一或密切相關。“肺與大腸相表里”理論早已在中醫學記載，現代學者對其理論內涵和臨床應用已有許多方面的研究，成果頗豐?，F代研究認為肺與大腸在生理、病理信息表達上存在共振現象：信息通路傳導、微生物菌群協調、相同黏膜免疫機制、特殊分子表達、胚胎早期同源性。肺與大腸相表里理論臨床應用廣泛，主要是腸病治肺、肺病治腸、肺腸同治等。但在PQ中毒肺損傷中的應用目前未見文獻報道。筆者在“肺與大腸相表里”理論指導下，應用桃仁承氣湯使PQ瀉下而逐瘀，通腑氣以利肺氣，利肺氣以助血行，從而發揮肺主治節的功能［12］，待進一步驗證。

在本實驗中，我們制作了大鼠PQ灌胃中毒急性肺損傷模型，探討了桃仁承氣湯對PQ中毒引起的大鼠肺損傷的保護作用及機制，分別在分子及蛋白水平、病理學等檢測了炎癥因子、氧化應激等相關指標，結果顯示：桃仁承氣湯對PQ染毒大鼠肺的炎癥反應因子、氧化應激水平有影響；對肺組織病理學改變方面有影響；桃仁承氣湯對中毒大鼠一般狀況、生存時間有影響。從本實驗結果具體分析如下：與PQ模型組比較，桃仁承氣湯治療組HMGB1水平及MDA含量相對降低，SOD活力相對升高，IL-6及TNF-α的水平也相對降低。從光鏡下和病理學評分可以看出，桃仁承氣湯能明顯改善PQ對肺組織的病理損傷；生存時間、生存率較PQ組明顯提高，可以推論桃仁承氣湯能延長PQ中毒急性肺損傷大鼠的生存時間。在抗氧化應激的方面，桃仁承氣湯能抑制MDA的活性，提高SOD的活性，從而發揮了抗氧化應激作用；炎癥因子水平檢測結果提示桃仁承氣湯能抑制IL-6、TNF-α、HMGB1等炎癥因子的釋放。姚永明等［13］認為HMGB1可分泌到細胞外，可與TNF-α、IL-6等重要炎癥因子相互誘生。循環HMGB1在膿毒癥后期升高，有可能作為一種晚期炎癥介質參與膿毒癥的發生與發展過程［14］。HMGB1被認為既是炎癥早期的啟動者，又是炎癥晚期的促進者［15］。炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡與自噬等都可能參與到ALI的發生發展過程中，而這些病理變化之間又有千絲萬縷的關系，相互交錯，構成復雜性網絡，共同作用［16-17］。桃仁承氣湯的瀉下逐瘀、通腑利肺、肺主治節功效主治原則在PQ中毒大鼠肺損傷炎癥反應調控和信號通路機制中有體現［18-20］。總之，桃仁承氣湯可能通過抑制HMGB1及其與IL-6、TNF-α等炎癥因子相互誘生和通過抑制MDA、提高SOD活力從而實現對PQ中毒大鼠急性肺損傷的保護作用。