五苓散對腎陽虛型口干燥癥小鼠頜下腺AQP-5的分布表達研究?

陳麗瑩 王潔宜 朱瀟瑩 倪哲婷 江詩夢 王新昌

（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053；2.浙江省新華醫(yī)院，浙江 杭州 310005）

口干燥癥是指口腔干燥以及口腔功能的喪失，具體可由衰老、藥物使用不當、頭頸部惡性腫瘤的放射治療以及干燥綜合征等相關因素引起。老年群體是口干燥癥的高發(fā)群體，是虛證的常見癥狀，陽虛質在老年偏頗體質中所占比例較高［1］。中醫(yī)認為，在老年患者群體中，陽氣無法推動津液在人體表里上下的輸布，可導致“消渴”“煩渴”等癥狀的出現，五苓散對治療口干燥癥頗有療效。同時，現代醫(yī)學表明，水孔蛋白-5（AQP-5）和口干燥癥有著緊密的聯(lián)系，它是一種主要分布在唾液腺中的跨膜通道蛋白，具有水滲透性特征。正常情況下，它存在于細胞內囊泡內，在受到體內外某些刺激后，出現由囊泡向細胞頂膜“轉位”的現象，從而促進了唾液腺的正常分泌。目前尚未有關于應用五苓散改善口干燥癥機制的研究，故本實驗從中醫(yī)化氣布津的治則出發(fā)，假設五苓散能通過調控AQP-5分布表達治療腎陽虛型口干燥癥小鼠，以此并展開研究討論，為從現代醫(yī)學角度解釋五苓散治療老年患者腎陽虛型口干癥燥提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4周齡的ICR小鼠，SPF級，雌性，體質量（20±2）g，購買于上海斯萊克實驗動物公司，生產許可證號：SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心室，許可證號：SYXK（浙）2013-0184，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±2）℃，相對濕度（50±10）%。

1.2 藥物與試劑 五苓散，組方：茯苓9 g，澤瀉15 g，豬苓9 g，桂枝6 g，白術（炒）9 g。藥材購于浙江中醫(yī)藥大學名醫(yī)館，分2次煎煮并合并藥液，隨后將藥液稀釋成1 g/mL，4℃保存。氫化可的松注射液（5 mL∶25 mg），天津金耀藥業(yè)有限公司生產，批號H12020886。AQP-5小鼠單克隆IgG1抗體（D-7）：sc514022，購于美國Santa Cruz公司。

1.3 分組與造模 將27只ICR小鼠隨機分為空白組、模型組、五苓散組，每組9只。模型組、五苓散組每天按25 mg/kg肌肉注射氫化可的松，每日1次，連續(xù)10 d，自由飲水，控制飼料量為每日100～125 g/kg體質量，連續(xù)10 d。空白組每天按0.2 mL/10 g肌肉注射生理鹽水，自由飲水、飲食，每日1次，連續(xù)10 d。造模后小鼠較空白組出現體質量下降（P<0.05）、飲水減少（P<0.05）、精神倦怠、蜷曲拱背、活動減少、反應遲緩、肢尾發(fā)冷、皮毛無光澤、大便稀溏等腎陽虛表現，說明造模后期小鼠“陰損及陽”的證候改變和老年臟器衰微的氣化功能衰退，提示造模成功。

1.4 給藥方法 中藥組按照小鼠（20 g）體表面積與成人體表面積（70 kg）比計算中藥量，換算系數為0.0026，造模第11天后中藥組按照每日0.2 mL/10 g灌胃藥液，模型組和空白組按照每日0.2 mL/10 g灌胃蒸餾水。各組小鼠自由飲水、飲食，每日1次，連續(xù)10 d。

1.5 一般狀況觀察 1）觀察造模后小鼠精神狀態(tài)、皮毛疏松程度等現象。2）每日測體質量1次，并記錄。3）每日測各組水瓶的質量，飲水量=（后一天的飲水量-前一天的飲水量）/小鼠數量。4）測定每只小鼠唾液流量，測定前禁食1 h，不禁水。在小鼠的后頰部用鑷子放入5 mg的干燥無菌脫脂棉球，5 min后取出，電子分析天平上稱重。唾液流量（mg）=棉球濕質量-棉球干質量。

1.6 標本采集與檢測 1）頜下腺指數、病理變化。于末次給藥后次日處死小鼠，分離雙側頜下腺稱質量，頜下腺指數（%）=頜下腺濕質量（g）/小鼠體質量（g）×100%。頜下腺以40%的多聚甲醛固定24 h后沖洗，經酒精逐級脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，切成5 μm厚的薄片，HE常規(guī)染色。100倍光鏡下觀察頜下腺病理改變。2）免疫組化法檢測頜下腺AQP-5分布表達。采用免疫組化法，頜下腺蠟塊組織切片，烘烤脫蠟及過水；切片上依次滴加抗原修復液、正常山羊血清封閉液、第一抗體（稀釋濃度為1∶200）、生物素化第二抗體（IgG）、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP）；DAB顯色；蘇木精復染后透明、中性樹脂封片。AQP-5陽性顆粒DAB顯色為棕褐色及棕黃色。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示。比較采用獨立樣本t檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠一般狀況及頜下腺指標比較 見表1。與空白組比，模型組飲水量和唾液流量減少，頜下腺指數明顯下降，導管上皮個數明顯減少，表示頜下腺出現明顯萎縮，具有明顯統(tǒng)計學差異（P<0.05）；五苓散組較模型組飲水量和唾液流率增加，頜下腺指數上升，具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），導管上皮個數有所增加（P>0.05），表示頜下腺萎縮有所緩解。

表1 各組小鼠飲水量、唾液流量、頜下腺指數、導管上皮細胞個數比較（±s）

與空白組比較，?P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

組別空白組模型組五苓散組n 9 9 9飲水量（mL）5.95±0.55 5.69±0.36*5.73±0.93△唾液流量（mg）23.00±1.90 4.83±1.72*15.33±1.50△頜下腺指數（%）2.87±1.76 0.38±0.05*0.47±0.06△導管上皮個數（個/mm2）93.35±17.18 55.37±13.47*66.52±18.03

2.2 各組小鼠頜下腺組織病理學觀察 見圖1。空白組腺泡細胞、導管和毛細血管形態(tài)正常。模型組出現腺泡細胞萎縮、導管和毛細血管擴張，纖維組織增生等。與模型組相比，五苓散組腺泡細胞萎縮、導管和毛細血管擴張，纖維組織增生等表現減少。

圖1 各組頜下腺病理切片（HE染色，100倍）

2.3 各組小鼠頜下腺免疫組化AQP-5蛋白分布表達 見圖2。空白組AQP-5的表達分要分布在腺泡細胞的頂膜和基底膜中，在導管上皮中表達較少，染色顯示棕黃或棕褐色顆粒；模型組染色明顯減弱甚至消失；五苓散組可見中等量染色區(qū)域，較模型組染色明顯。

圖2 各組頜下腺AQP-5蛋白表達（DAB染色，100倍）

3 討 論

水孔蛋白（AQPs）在調節(jié)唾液分泌的水滲透性方面起著重要作用，可以根據滲透壓/靜水壓力梯度快速進行水的跨膜運動［2］。目前已在哺乳動物中鑒定出13個家族成員（AQP0-AQP12）。鑒于水分運動與唾液分泌息息相關，因此我們選擇在唾液腺中研究AQPs的表達、定位和功能。從功能上講，AQP-5似乎是迄今為止唯一一個在唾液分泌過程中發(fā)揮重要作用的AQP，主要分布在唾液腺的頂膜和基底膜中，與口干燥癥的發(fā)病有著密切聯(lián)系。AQP-5-KO小鼠是唾液腺分泌生理作用的有效模型［3］。在AQP-5-KO小鼠中，毛果蕓香堿刺激的唾液減少超過60%［4］。生理上通過下頜下腺的副交感神經和腮腺中的交感激動劑控制，而且自噬和溶酶體介導的降解以及鈣調蛋白都參與調控。在病理條件下，LPS在腮腺中的誘導導致NF-κB/MAPK通路被激活，導致轉錄因子NF-κB和AP-1（c-Fos/c-Jun）被激活，形成與NF-κB原件結合的復合物從而下調AQP-5 mRNA的轉錄［5］。干燥綜合征（一種唾液腺功能減退，以口眼干燥為特征的自身免疫性疾病）中毒蕈堿受體自身抗體導致毛果蕓香堿誘導AQP-5向頜下腺細胞頂膜的運輸減少，表明AQP-5在毒蕈堿受體激動劑誘導的胞吐作用中對唾液腺頂膜運輸的重要性［6］。益氣養(yǎng)陰祛瘀方可通過調節(jié)AQP-5和毒蕈堿膽堿受體3（M3R）通道的作用，從而改善唾液腺的水分分布［7］。各種激動劑對唾液分泌的刺激作用會隨著年齡的增長而降低。在M3R中起作用的乙酰膽堿對細胞頂膜中AQP-5水平的刺激作用在衰老過程中顯著降低。在老化期間，M3R和Gq蛋白的量沒有減少，而是降低一氧化氮合酶的活性。有研究表明，口干燥癥和干燥綜合征患者AQP-5 mRNA表達沒有明顯差異，主要定位于基底膜和腺泡細胞的頂膜中，但未定于導管細胞膜。口干燥癥患者腺泡細胞頂膜AQP-5染色的強度高于對照組，干燥綜合征組低于口干組。AQP-3在口干患者頂膜中幾乎不表達。AQP-5和AQP-3在小唾液腺頂膜中的分布可能是區(qū)分干燥綜合征和口干患者的關鍵因素，但易受到AQP單克隆抗體差異的影響［8］。奎寧環(huán)衍生物SNI-2011（乙酰膽堿類似物，可作用于M3R）誘導頂膜中AQP-5水平的持續(xù)增加，可能對治療與年齡相關的口干燥癥具有治療益處［9］。也有研究表明5-Aza-CdR，一種脫甲基化劑治療老年小鼠的AQP-5蛋白的表達水平遠遠高于未經治療和幼鼠的蛋白表達水平，因此認為脫甲基化劑可能是恢復老年人唾液分泌的有效藥物，有利于老年口干燥癥的治療［10］。總之，以AQP-5為靶點治療干預與年齡相關的口干燥癥被認為是有前景的策略。

在動物模型選擇上，氫化可的松誘導模型是目前較為理想的腎陽虛模型。激素的應用可使機體在起初呈現煩躁多動等陰虛表現，但是激素的突然停用會導致下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸抑制狀態(tài)暴露，導致機體對外界環(huán)境變化的應激、適應能力顯著下降，水、電解質代謝失調，從而表現一系列的腎陽虛證候，恰符合中醫(yī)所描述的“陰損及陽”的病理過程［11-12］。不僅如此，從HPA軸指標上看，氫化可的松模型也更符合腎陽虛證的要求，且對腎臟無損傷［13］。同時在選擇氣虛模型上，筆者也參考了李軍蘭等［14］通過限制ICR小鼠日攝食量的方法建造氣虛證模型，以模擬老年患者臟器衰微，氣化不利的表現。最后，筆者采用氫化可的松誘導聯(lián)合限制日攝食量法建造出在氣虛基礎上的陽腎虛證模型。造模結束時筆者發(fā)現這些小鼠不但符合腎陽虛的一系列表現，而且頜下腺出現明顯萎縮，且伴有飲水量、唾液流量減少的一系列口干癥狀，十分符合該實驗的造模目的，提示造模成功。

五苓散出自《傷寒論》，是基于化氣布津理論，治療氣化不利，水液內停，甚至有飲的主要方劑之一。五苓散主要用于治療水液代謝障礙性疾病，在臨床實際中水液代謝失常出現的少水、積水情況也屬于五苓散證。其中就包括由于腎陽虛衰，津液輸布失常所導致的口干燥癥［15］。《素問·陰陽應象大論》中強調“陽化氣，陰成形”，陽氣不足、陰氣過盛是導致津液輸布失司，甚至產生水飲的基礎病機。而五苓散雖多見利水滲濕藥，卻是以一味桂枝為主，以桂枝通陽化氣，助津液調節(jié)，恢復津液吸收、輸布與排泄等正常功能，不僅體現了仲景水病重氣化的治療方法［16］，也與《溫病條辨》中所說的“善治水者，不治水而治氣也”相一致［16］。

本研究結果發(fā)現：通過制作在氣虛基礎上的腎陽虛模型，小鼠唾液腺體萎縮，腺體功能衰退，AQP-5的分布表達發(fā)生變化，AQP-5在頂膜的表達更弱，而在基底膜中表達為陽性。相比較于模型組，通過五苓散干預氣虛基礎上的腎陽虛模型小鼠，小鼠的飲水量、唾液流量增加，頜下腺指數升高，導管上皮細胞個數增加，AQP-5在頂膜處染色更強。臨床上老年患者臟器衰微，氣化不利，陽虛型體質多見，陽氣無以鼓動，或因干燥綜合征使用激素，后期陰損及陽，所以引發(fā)的口干往往是由于津液不布，而非津液虧虛。因此，筆者從化氣布津的中醫(yī)理論出發(fā)，認為五苓散能夠通過陽氣的溫煦、氣化及蒸騰作用，進而調整AQP-5在頜下腺的分布表達，在一定程度上緩解口干燥癥的癥狀［17］。然而僅使用組織切片無法區(qū)別AQP-5在腺泡和導管細胞中的運輸，若能采用激光共聚焦顯微鏡進一步研究AQP-5的運輸功能，更有探索價值。本次實驗研究結果，或為中醫(yī)化氣布津理論提供現代化的思考，也為臨床中應用五苓散治療老年腎陽虛型口干燥癥提供一定的現代醫(yī)學依據。