β-細辛醚對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬區突觸蛋白PSD-95表達的影響

榮華 孫曉雪

由于人口老齡化趨勢愈加嚴重，老年性疾病問題十分突出，阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種嚴重危害老年人健康的疾病，它屬于起病隱匿且病程緩慢的中樞神經退行性疾病，與人類機體衰老有十分密切的關系，已成為繼腫瘤及心血管疾病之后危害老年人群健康最為嚴重的疾病以及造成死亡的原因[1]。現在針對AD 診斷，重要的病理特征表現為細胞外的老年斑及細胞內的纖維纏結，并且在腦組織中積聚大量的Aβ-蛋白，從而破壞神經突觸的完整性和可塑性，使突觸丟失及功能喪失[2，3]。癡呆早期明顯的病理表現主要是突觸的丟失，這說明它們之間有很大的關聯性，并且突觸發生損害同時也是記憶出現障礙的基礎[4]。目前為止，醫學上對AD 的治療效果并不理想，不僅不能從根本上達到治療疾病的效果，而且副作用較多。

通過現代藥理學研究得知，中藥石菖蒲有開竅豁痰、醒神益智、抗抑郁等作用，在臨床中被經常用于AD、癲癇、腦中風等神經系統疾病的治療[5]。其的主要成分為揮發油，而β-細辛醚是其中最主要的化學成分[6]。基于此，我們采用APP/PS1 雙轉基因小鼠模型，從突觸可塑性角度來進行研究，探討石菖蒲主要成分β-細辛醚對AD 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑β-細辛醚，天津一方科技有限公司（CAS：00011017-T9K）；鹽酸多奈哌齊（donepezil hydrchloride tablets，DHT）衛材（中國）藥業有限公司（CAS：C14200012042）；PSD-95 一 抗，美 國Cell Signaling Technology 公司（CAS：3409T）。

1.1.1 動物 2月齡APP/PS1 雙轉基因小鼠40 只，C57BL/6 小鼠10 只，南京大學-南京生物醫藥研究院提供，生產許可證編號：SCK（蘇）2015-0001。

1.1.2 儀器設備 Stratagene Mx3005P 型實時熒光定量PCR（Real-time PCR）儀（美國Agilent 公司），S1000TM熱循環儀（美國Bio-Rad 公司），XPE504 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司），AlphImagerTM圖像分析系統（美國Alphaimager 公司）。

1.2 分組及給藥隨機將轉基因小鼠分為模型組、鹽酸多奈哌齊組（0.33mg·kg-1·d-1），β-細辛醚低劑量組（25mg·kg-1·d-1）、高劑量組（50mg·kg-1·d-1），同時選擇C57BL/6 小鼠為空白對照組，與模型組給予等體積的生理鹽水，連續4 周。

1.2.1 行為學檢測 當給藥周期結束后，應用Morris水迷宮方法對實驗小鼠進行行為測試。直徑為150cm，高60cm 的圓形不銹鋼水池，內置高40cm無色有機玻璃平臺。利用水迷宮的中心作為原點，在水池四周側壁上標記東、西、南、北，作為進水點。將玻璃平臺放入水中，注水，池內的水溫要求達到（22±1）℃，加入適量奶粉，使水呈乳白色，安全平臺要低于液面臺要求1cm，練習期間周圍環境要求保持安靜，參照物不能改變。

1.2.2 定位巡航實驗 實驗時間為期5d，4 次/d，選取東側作為入水點，自動攝像系統記錄小鼠尋找到水下平臺時間（逃避潛伏期），設定逃避潛伏期的時間為60s。

1.2.3 空間探索實驗 當進行6d 定位航行實驗結束后，將玻璃平臺從乳白色水面移出，在相同進水點放入小鼠，記錄小鼠在沒有安全平臺的情況下尋找記憶中平臺的次數，設定時間為60s 內小鼠跨越平臺位置的次數。

1.2.4 剛果紅染色檢測小鼠海馬CA3 區Aβ-淀粉酶沉積的變化 配置剛果紅染液：剛果紅0.5g，甲醇溶液80ml。石蠟組織切片脫蠟至水化，剛果紅染液室溫孵育30min，分化液分化數秒，沖洗，蘇木素復染2min，清水沖洗后進行梯度脫水，透明，封片，光學顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 免疫熒光標記檢測小鼠海馬CA3 區PSD-95蛋白表達的變化 將冰凍的腦組織切片置于甲醇溶液中浸泡10min，滴加PBS 清洗液漂洗3 次，高壓修復2min 后冷卻至室溫，37℃條件下免疫血清孵育20min，滴加適當比例稀釋的一抗工作液，4℃過夜。次日，PBS 溶液沖洗切片后，滴加二抗工作液避光40min，封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 RT-PCR 檢測各組小鼠海馬PSD-95mRNA 的表達 給藥結束后，冰上迅速取出腦組織，快速定位海馬并進行剝離，將海馬組織剪成乳糜狀，按照比例要求，每50mg 海馬組織加入1ml 的TRIzon 試劑，使用移液器將液體吸入到預先高壓處理過的EP 管中。加入氯仿，每使用1ml 的TRIzon 試劑加入0.2ml的氯仿，劇烈震蕩20s，室溫放置3min。加入DEPC水30μl，使RNA 充分溶解，配制濃度為1%的瓊脂糖凝膠，吸取2μl RNA 樣品，加入1μl 的上樣緩沖液，混勻加入配好的瓊脂糖凝膠中進行電泳，鑒定所提取RNA 的純度及完整性。在冰上配制反應體系試劑，按要求設置擴增條件：95℃ 30s；95℃ 5s；60℃ 31s；共40 個循環。引物序列如下：上游引物：5'-CACTGACAACCCGCACATC-3'；β-actin：上游引物：5'-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3'；下游引物：5'-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA -3'。反應結束后，進行數據的分析與處理，通過2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

1.3 統計學方法采用SPSS 20.0 統計軟件進行單因素方差分析，計量資料以±s表示，兩組間用SNK 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 β-細辛醚對APP/PS1 雙轉基因小鼠學習記憶能力的影響藥物治療結束以后，通過水迷宮行為學檢測發現，與空白對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期時間增加，對平臺的跨越次數減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組與β-細辛醚各劑量組小鼠逃避潛伏期時間明顯縮短，對平臺跨越的次數增多，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠逃避潛伏期和跨越平臺次數比較（±s）

表1 各組小鼠逃避潛伏期和跨越平臺次數比較（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 n 逃避潛伏期（s） 跨越平臺次數（次）空白對照組 10 9.33±1.59 5.93±0.50模型組 10 56.73±4.15a 1.67±0.31a鹽酸多奈哌齊組 10 26.80±4.06b 4.13±0.12b β-細辛醚低劑量組 10 33.40±4.15b 3.27±0.31b β-細辛醚高劑量組 10 23.80±3.91b 5.07±0.23b

2.2 β-細辛醚對APP/PS1 雙轉基因小鼠海馬CA3區Aβ-淀粉沉積的影響藥物治療結束以后，應用剛果紅染色法檢測每組小鼠海馬CA3 區Aβ-淀粉樣沉積的變化。結果顯示，與空白對照相比較，模型組小鼠海馬區Aβ-淀粉沉積明顯增多，與模型組比較，β-細辛醚高低劑量組均可降低Aβ-淀粉沉積，而高劑量組治療效果要好于低劑量組，且與陽性對照藥物鹽酸多奈哌齊作用相一致。見圖1。

圖1 各組小鼠海馬CA3 區Aβ-淀粉沉積變化

2.3 各組小鼠海馬CA3 區PSD-95 蛋白表達的變化給藥結束后，采用免疫熒光技術標記突觸功能可塑性相關蛋白PSD-95，檢測β-細辛醚對蛋白的影響。結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠海馬CA3 區的PSD-95 表達量降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；β-細辛醚低劑量組、β-細辛醚高劑量組、鹽酸多奈哌齊組與模型組相比較，表達量相對升高（P＜0.05），高劑量組作用效果好于低劑量組。見表2。

表2 各組小鼠海馬CA3 區PSD-95 表達（±s）

表2 各組小鼠海馬CA3 區PSD-95 表達（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 n PSD-95空白對照組 10 1.00±0.01模型組 10 0.59±0.06a鹽酸多奈哌齊組 10 0.79±0.04b β-細辛醚低劑量組 10 0.70±0.05b β-細辛醚高劑量組 10 0.76±0.05b

2.4 各組小鼠海馬CA3 區PSD-95mRNA 的表達在結束4 周給藥治療后，與空白對照組比較，模型組小鼠海馬CA3 區PSD-95mRNA 表達下調，有顯著差異（P＜0.05）；與模型組比較，β-細辛醚低劑量、β-細辛醚高劑量、鹽酸多奈哌齊均能夠上調PSD-95mRNA 的表達，且高劑量組效果好于低劑量組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠海馬區PSD-95mRNA 的表達（±s）

表3 各組小鼠海馬區PSD-95mRNA 的表達（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 n PSD-95mRNA空白對照組 10 0.98±0.45模型組 10 0.45±0.10a鹽酸多奈哌齊組 10 0.73±0.11b β-細辛醚低劑量組 10 0.69±0.05b β-細辛醚高劑量組 10 0.71±0.05b

3 討論

老年癡呆癥在人步入老年期間出現，表現為癡呆癥狀的所有疾病，因此它的發生與年齡相關，多在50 歲以后起病。此病發病的主要臨床特征表現為記憶力減退，以及嚴重的認知障礙，并將會伴有不可逆的行為及社交障礙。隨著病情加重會導致患者失去自主生活能力甚至會帶來嚴重的并發癥而致死亡[7]。

近年來對AD 的研究，國內外研究者提出諸多假說，研發出多種藥物應用于臨床治療，但是到目前為止AD 發病機制并不十分明確，對于藥物治療效果也是差強人意。許多研究證實，在神經系統中，細胞間的聯系主要是以突觸的傳遞作用為基礎，神經元對信號的接受與處理功能需要借助突觸連接來實現，基于此它的損傷與缺失是影響認知功能的重要神經生物學因素之一[8，9]。神經系統的可塑性在很大程度上是由突觸的形態結構、數量以及功能狀態調節等方面決定的。

PSD-95 是突觸后膜骨架蛋白及突觸后致密物質的主要成分，穩定性非常高，它能夠將信號分子、調節分子和靶分子聯系起來，參與突觸后膜受體的激活及下游信號的傳導，在神經元對神經傳導信號的應答過程中發揮重要作用[10～12]，同時PSD-95 能夠接受和整合突觸信號并將其傳導給突觸后細胞，作為突觸后膜上的腳手架蛋白能夠維持突觸后膜結構的穩定，因此它在突觸可塑性中有重要作用，而且也成為突觸重建水平的重要檢測標志[13]。

中醫認為AD 的病位在腦。《本草備要》曰：“人之記性，皆在腦中……凡人外見一物，必有一形影留于腦中……今人每記憶往事，必目上瞪而思索之，此即凝神于腦之意也[14]。”中醫早就已經認識到腦具有記憶、思維、感知功能，AD 的發生是由于腦萎縮，大腦功能退化所致。《本草備要》曰：“老人健忘者，腦漸空也。”《醫林改錯》更是認同“靈機記性在腦”、“腦氣虛，腦縮小”、“高年無記性者，腦髓漸空[15]”。自古以來石菖蒲作為醒腦開竅類佳品，是應用于腦部疾病的中藥方劑中出現頻率非常之高的藥物。近些年來，石菖蒲的化學成分、藥理研究、臨床應用等方面也有較系統的研究。

石菖蒲含揮發油（0.01%～2.15%）及糖類、機酸、氨基酸等。揮發油中含34 種成分，主要為β-細辛醚63.2%～81.2%、α-細辛醚3.4%～13.7%，其次為石竹、α-葎草烯、石菖醚、細辛醛等[16]。許多實驗研究表明石菖蒲揮發油的有效成分有促進學習記憶的作用[17]。石菖蒲具有益智健腦、抗抑郁等作用，醫學界經常用它治療神魂癲癇、健忘、耳聾等神經系統疾病[18，19]。

本研究采用APP/PS1 雙轉基因小鼠作為研究對象，通過水迷宮實驗來檢測石菖蒲有效成分β-細辛醚對各組小鼠學習記憶能力的影響。實驗結果顯示，模型組小鼠尋找跨越安全平臺次數明顯減少，與此同時逃避潛伏期的時間有所增加，而β-細辛醚組癡呆小鼠這種反應遲鈍的行為有所改善，小鼠跨越平臺的次數明顯增多，逃避潛伏期的時間有一定的縮短，顯著提高小鼠學習記憶能力，說明β-細辛醚能夠改善癡呆模型小鼠相似于AD 患者出現的行為學癥狀。剛果紅染色檢測得出結果提示，β-細辛醚可以降低小鼠腦中Aβ-淀粉樣沉積，說明β-細辛醚可以緩解Aβ-淀粉酶誘導的突觸可塑性功能障礙，并且能夠在突觸功能維持和改善中發揮一定的保護作用。

本研究發現β-細辛醚通過調節神經突觸可塑性重要蛋白PSD-95 表達的變化，進而進一步研究藥物治療AD 的作用機制。通過免疫熒光結果可知，與空白對照組比較，模型組小鼠PSD-95 的蛋白表達相對降低，與模型組比較，β-細辛醚高劑量組更能明顯升高轉基因小鼠海馬區PSD-95 的蛋白表達。RT-PCR 檢測結果顯示，β-細辛醚能夠上調小鼠海馬區PSD-95mRNA 的表達，進一步達到穩定突觸連接，改善突觸可塑性，恢復信號相關傳遞的功能。由此可以推斷，β-細辛醚通過調節小鼠神經突觸可塑性相關功能蛋白PSD-95 的變化來發揮抗AD 的作用，同時本研究也為尋找防治AD的新作用靶點的藥物提供理論研究基礎。