小麥紋枯病抗性QTL分析

周淼平，姚金保，楊學明，張 鵬，余桂紅

(江蘇省農業科學院糧食作物研究所，江蘇南京 210014)

小麥紋枯病(wheat sharp eyespot，WSE)是發生在溫帶地區的世界性病害，在歐洲、北美洲、非洲、大洋洲和亞洲均有發生[1]。在中國，該病害主要由禾谷絲核菌(RhizoctoniacerealisVan der Hoeven)侵染小麥莖稈基部引起[2]，侵染后，造成莖稈基部腐爛，小麥抗倒伏能力下降，由于病原菌菌絲堵塞，植株上部營養和水分的輸送發生困難，嚴重時發生死苗和枯白穗，導致產量損失。據報道，中國每年小麥紋枯病發生面積超過600萬公頃，僅2005-2008年，由于該病害造成的損失超過10億元[3]。培育和使用抗病品種是減輕小麥紋枯病危害最經濟、環保和有效的方法。

遺傳分析表明小麥對紋枯病的抗性是多基因控制的數量性狀[4-5]。分子數量遺傳學的發展，使得定位和聚合小麥紋枯病抗性QTL成為可能。迄今為止，已經對小麥紋枯病抗源ARz[6]、川35050和山農0431[7]、白免3號[8]、AQ[5]、Niavt14[9]和CI12633[10]的抗性QTL進行了初步定位，在1A、2B、2D、3B、3D、4A、4B、5A、5B、5D、6A、6B、7B和7D染色體上均發現抗性QTL，但大多QTL表型解釋率較低，且未發現抗性穩定的主效QTL，因此，繼續篩選抗病種質資源、挖掘新的抗性QTL以及微效抗性QTL的聚合將是今后小麥紋枯病研究的主要內容[5]。

已報道的小麥紋枯病抗性QTL定位研究大多采用SSR標記，但該標記的多態性低，構建的遺傳連鎖圖對小麥基因組的覆蓋度較差，影響抗性QTL的檢出效率。SNP芯片技術和高通量測序技術的發展為高密度遺傳連鎖圖的構建提供了便利，Wu等[10]采用90K SNP芯片對CI12633/揚麥9號重組自交系群體進行了基因型分析，構建了12 434.23 cM的高密度遺傳連鎖圖，定位了5個有關小麥紋枯病抗性的QTL位點，但這些QTLs位點在不同試驗中的表型解釋率總和仍然偏低，只有22.2%～63.7%，表明仍有不少紋枯病抗性QTL位點未被檢出。

本研究以CI12633/揚麥158重組自交系群體中的94個家系為材料，采用二代測序技術開發SNP新標記，構建高密度遺傳連鎖圖，結合牙簽接種和病麥粒接種的方法鑒定重組自交系群體的紋枯病抗性，進行小麥紋枯病抗性QTL分析，以期獲得更多的抗性QTL位點，為今后解析小麥紋枯病抗性機制以及開展抗小麥紋枯病標記輔助育種提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以感紋枯病品種揚麥158(江蘇省里下河地區農業科學研究所提供)為母本，抗紋枯病品種CI12633(江蘇省農業科學院種質資源與生物技術研究所提供)為父本，配制雜交，采用單粒傳的方法構建重組自交系群體，該群體含有198個家系，分析時已達F8代，本研究對其中94個家系進行了基因型分析和紋枯病抗性鑒定。

禾谷絲核菌R0301由江蘇省農業科學院植物保護研究所陳懷谷研究員提供，該病菌為江蘇麥區致病力較強的小麥紋枯病病原菌。

1.2 重組自交系群體遺傳連鎖圖的構建

重組自交系群體的親本和各家系的葉片DNA提取參照Saghai-Maroof等[11]的方法。

SSR標記分析：根據GrainGenes網站提供的SSR標記引物序列(https://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/GG3/browse.cgi?class=marker)合成引物，在親本間篩選多態性SSR標記，用于重組自交系群體各家系的基因型分析。

SNP標記分析：采用ddRAD-seq(double digest restriction site-associated DNA sequencing)技術開發SNP標記，重組自交系家系和親本的基因組DNA分別采用限制性內切酶EcoRⅠ和NlaⅢ酶切并連接EcoRⅠ接頭和NlaⅢ接頭，瓊脂糖凝膠電泳后回收400～600 bp連接產物，DNA定量后，等量混合24個樣品，采用Illumina TruSeq DNA Library Prep Kits進行DNA文庫構建，測序。測序數據處理后，通過reads間聚類方法以及與小麥參照基因組的比對，搜尋在親本間存在的多態性ddRAD標簽，開發SNP標記，并在重組自交系各家系進行分析。

根據重組自交系群體的SSR和SNP 分析結果，采用JoinMap 4.0軟件構建各染色體遺傳連鎖圖。

1.3 重組自交系群體的紋枯病抗性鑒定

重組自交系群體的紋枯病抗性鑒定分別采用牙簽接種法和病麥粒表土接種法進行。

牙簽接種法：牙簽置于燒杯等容器內，清水沖洗浸泡過夜，瀝干，加入已融化的PDA固體培養基，浸沒牙簽1/2，滅菌并凝固后，接種新鮮培養的禾谷絲核菌R0301，25 ℃黑暗培養，菌絲長滿牙簽后備用。于小麥拔節期接種，取帶菌牙簽，插于葉鞘與莖稈之間，小麥彌霧保濕7 d，每個重組自交系家系和親本接種50個莖稈，于小麥乳熟期調查紋枯病病級，計算平均病情指數，每個試驗重復2次。牙簽接種于2005-2007年在江蘇南京江蘇省農業科學院本部試驗地連續3次試驗。

病麥粒接種法：小麥籽粒清水浸泡24 h，瀝干，裝袋滅菌，采用1 cm見方長有禾谷絲核菌R0301的PDA瓊脂培養基接種，25 ℃培養，2 d翻動1次小麥籽粒，直至籽粒均勻布滿菌絲備用。于小麥返青期接種，在小麥行間劃淺溝，均勻撒播病麥粒后覆土，每天早晚噴水1次，連續7 d，病麥粒用量150 kg·hm-2。于小麥乳熟期調查紋枯病病級，每個家系和親本調查50個莖稈，計算平均病情指數，每個試驗重復2次。病麥粒接種分別于2006年在江蘇揚州里下河地區農科所試驗地、2012-2014年在江蘇南京江蘇省農業科學院本部試驗地進行。

小麥紋枯病病級按以下標準確定：0級，葉鞘和莖稈均未見紋枯病病斑；1級，葉鞘有典型紋枯病病斑，但不侵莖；2級，病菌侵入莖稈，但病斑環莖寬度不超過莖稈周長的1/2；3級，病斑環莖寬度是莖稈周長的1/2～3/4；4級，病斑環莖寬度繞莖稈3/4以上，或莖稈已軟腐；5級，枯孕穗或枯白穗。

病情指數按以下公式計算：病情指數=[(Σ各級病株數×各級代表值)/(總株數×最高級代表值)]×100%

1.4 數據分析和QTL定位

重組自交系群體和親本紋枯病抗性鑒定的數據平均值和頻率分布、試驗間相關性和方差分析均采用R軟件計算。

QTL定位采用MapQTL 5.0軟件進行，先進行QTL區間作圖(interval mapping)，然后采用軟件篩選的輔因子(cofactors)進行多QTL作圖(MQM Mapping)，根據置換檢測(permutation test)推薦的LOD值判定是否存在QTL。

2 結果與分析

2.1 遺傳連鎖圖的構建

經親本多態性篩選和群體基因型分析，共有430個多態性SSR標記參與遺傳連鎖圖構建。采用ddRAD-seq技術共開發SNP多態性標記有 11 965個，剔除群體缺失數據超過5%以及共分離的標記，共有4 086個多態性SNP標記參與遺傳連鎖圖的構建。JoinMap 4.0軟件構建的遺傳連鎖圖含有31個連鎖群，均可分配到相應的染色體，總遺傳距離2 510.66 cM，含有分子標記 3 355個(表1)。

表1 群體遺傳連鎖圖概況

2.2 重組自交系群體的紋枯病抗性鑒定

重組自交系群體和親本的紋枯病抗性采用兩種方法進行，牙簽接種(YQ)分別于2005年(05YQ)、2006年(06YQ)和2007年(07YQ)在江蘇南京試驗地進行，病麥粒接種(BT)分別于2006年在江蘇揚州(06YZ)、2012年南京(12NJ)、2013年南京(13NJ)和2014年南京(14NJ)進行。群體7次試驗的偏度(skewness)和峰度(krutosis)值均接近于0，表明群體的病情指數基本呈正態分布，小麥紋枯病的抗性由多基因決定，群體中均有抗病和感病的超親家系出現。三年牙簽接種的群體平均病情指數為34.46%，平均變化范圍在 23.54%～53.09%；四年病麥粒表土接種的群體平均病情指數為27.19%，平均變化范圍在 18.10%～39.22%，病麥粒接種與牙簽接種相比，群體的紋枯病發病程度偏輕(表2)。

表2 群體紋枯病抗性鑒定概況

方差分析表明，牙簽接種中，群體的各家系間以及試驗間的方差達到極顯著水平，但家系與試驗的互作效應不顯著；病麥粒接種中，各家系間、試驗間以及家系與試驗互作的方差均達到極顯著水平(表3)。

表3 試驗的方差分析

2.3 紋枯病抗性鑒定試驗間的相關性

7個試驗間的相關系數在0.21～0.81之間，06YZ與牙簽接種試驗間的相關系數較低；牙簽接種試驗間平均相關系數為0.51，變化在0.34～0.71之間；病麥粒表土接種間平均相關系數為 0.66，變化在0.33～0.81(表4)。

表4 試驗間相關分析

2.4 紋枯病抗性QTL定位

2.4.1 牙簽接種方法

采用牙簽接種方法，共檢測到8個紋枯病抗性QTL位點，涉及8條染色體，全部來自于抗病品種CI12633，但QTL位點的穩定性不高，未能檢測到三年均表現一致的QTL，表明小麥紋枯病的侵染和擴展受環境因素影響較大。5A、1B和7D染色體上的抗性QTL在2年試驗中均能檢測到，其余3B、4B、5B、6B和4D染色體上的抗性QTL只在1年試驗中檢測到。定位的抗性QTL多為微效QTL，抗性表型解釋率在10.80%～26.80%之間，其中7D的表型解釋率最高，兩年分別為26.80%和 22.90%，為紋枯病抗病主效QTL(表5)。

表5 牙簽接種方法獲得的抗紋枯病QTLs

2.4.2 病麥粒接種方法

采用病麥粒接種法，共檢測到10個紋枯病抗性QTL位點，涉及9條染色體，其中2D染色體檢測到2個抗性QTL位點；位于6B和1D染色體的QTL在4年試驗中均能檢測到，為紋枯病抗性穩定QTL；6A染色體上的QTL在3年試驗中均能檢測到；5A、2B、7B和2D染色體的QTL可在2年試驗中檢測到；其余位于1B、4B和2D染色體抗性QTL只能在1年試驗中檢測到。除了7B染色體上的QTL由感病品種揚麥158貢獻外，其余QTL均來自抗病品種CI12633。所檢測到的紋枯病抗性QTL表型解釋率都較低，在9.10%～16.90%之間(表6)。

表6 病麥粒接種法獲得的抗紋枯病QTLs

采用牙簽接種方法和病麥粒接種方法均能在1B和4B染色體檢測到的QTL位點，推測這兩個QTL位點在小麥抗紋枯病中發揮重要作用。

3 討 論

近幾年隨著高通量分子標記分析技術的進步，使小麥等作物重要性狀的QTL定位發展迅速，群體基因型的分析時間縮短、遺傳連鎖圖的分子標記密度加大，QTL定位的精確度愈來愈高。特別是小麥全基因組測序和物理圖譜構建的完成，為小麥重要性狀QTL的定位、比較和功能候選基因的確定提供了極大方便。本研究采用二代測序方法，參照發表的小麥基因組物理圖譜，在CI12633/揚麥158群體中開發了11 965個SNP多態性分子標記，選用其中的4 086個開發標記并結合已有的SSR標記，構建了含3 355個標記、遺傳距離為2 510.66 cM的小麥遺傳連鎖圖，為小麥紋枯病抗性QTL的定位奠定了基礎。

前人的研究中，小麥紋枯病抗性QTL定位多以SSR標記為主，單個研究由于基因組覆蓋度不高，檢測到的QTL數量較少。本研究采用SNP高通量分子標記，通過牙簽接種和病麥粒接種兩種方法，分別檢測到8個和10個小麥紋枯病抗性QTL，涉及13條染色體，其中B組染色體均含有紋枯病抗性QTL，這也與以往B組染色體抗性QTL檢出率較高結果相符[5-10]。將本研究檢出的QTL與已報道的紋枯病抗性QTL在小麥基因組物理圖譜上進行比較，發現5A、3B和7D染色體的QTL分別與Wu等[10]、Chen等[5]和湯颋等[6]報道的相應染色體上的QTL位置接近，可能為同一QTL，檢出的其余QTL與已報道相應染色體的QTL位置不一致，可能為新檢出QTL。

本研究檢出的16個抗紋枯病QTL中，除了7B染色體的QTL由感病品種揚麥158貢獻外，其余全部來自抗病親本CI12633。Wu等[10]采用CI12633/揚麥9號重組自交系群體定位了4個來自CI12633的抗紋枯病QTL，分別位于4BS、5AL(2個)和5BS染色體，本研究只檢測到5AL.1 QTL，其余3個抗紋枯病QTL位置與已報到的QTL位置均不一致，這些新發現的抗性QTL對進一步揭示紋枯病抗源CI12633的抗性機制提供幫助。

小麥紋枯病抗性QTL定位的關鍵是群體紋枯病抗性的鑒定，田間紋枯病抗性的鑒定受環境影響很大，氣候條件、田間溫濕度和其他小麥基部病害都會對紋枯病抗性鑒定造成干擾，本研究定位的QTL大多只在2～3個試驗中出現，這也充分證明了這一點。因此，采用控溫控濕等措施減少環境誤差是今后進一步精確定位紋枯病抗性QTL的努力方向。另外，本研究遺傳群體個體數偏小也一定程度影響QTL的檢測，在今后的試驗中將予以改進。