基于性質分析建立HBc-VLP的高效純化技術

仲為錚 吳官梓 于貝禾

HBc-VLP由于其自身結構與免疫原性的顯著優勢而被廣泛研究，具有很大的應用前景，規模化制備技術卻一直是阻礙其發展和應用的瓶頸。常用的密度梯度離心由于處理量、時間長、成本高等只能用于實驗室規模的研究，而基于色譜技術的純化方法只有少數形成了完整的工藝，但收率低。同時，色譜技術主要集中在離子交換層析的研究，但是，大腸桿菌表達體系中，許多宿主蛋白和HBc-VLP與離子交換填料具有比較相近的親和力，會在一定程度上影響離子層析的效率，且離子交換層析中蛋白與填料間相互作用力較強，容易導致目的蛋白難以洗脫甚至發生結構的變化而失去免疫原性。為了解決HBc-VLP現有純化工藝收率、純度等各方面存在的不足，本研究立足HBc-VLP的顆粒結構與表面性質，通過分析發現HBc-VLP顆粒表面的突起區域含有較多的疏水性氨基酸，組成了一個個疏水性區域，賦予HBc-VLP表面較強的疏水性，因此發展了疏水層析為基礎的純化方法。

1. 蛋白的誘導表達

用培養基將菌種活化，然后在培養箱中37℃下培養直至長出單菌落 ，之后進行一級擴增培養，最后蛋白誘導表達

2.菌體的收集與破碎

將菌體離心收集后，進行超聲菌體破碎，然后棄去細胞碎片等沉淀，保留上清。

3.疏水層析純化HBc-VLP

取10 mL Butyl-S介質，裝柱，平衡緩沖液平衡十個柱體積。 60℃溫度處理30 min后的細菌破碎液上清30 mL，調節硫酸銨濃度為0.5 M，pH為7.0，上樣，用平衡緩沖液淋洗至基線走平并收集穿透組分。然后用不含硫酸銨的洗脫液進行洗脫，洗脫后收集。

4. 凝膠過濾層析精制HBc-VLP

疏水層析洗脫收集的15 mL洗脫液用100 kDa的超濾濃縮管進行濃縮，預裝柱預先用含0.15M NaCl 的20mM PB緩沖液平衡，將濃縮后的5 mL濃縮樣品上樣，分離后收集。

5.蛋白質濃度測定

蛋白濃度檢測根據 Bradford 的方法進行測定：

取 100 μL 樣品加入到G-250工作液中測定 595 nm 處的吸光值，帶入標準曲線方程即可計算得到樣品中的蛋白質濃度。

6. 聚丙烯酰胺凝膠電泳

樣品與 5×的上樣緩沖液按照 4：1 的比例混合，100℃處理 5 min。 根據具體實驗要求取一定體積（< 30 μL）的處理后樣品用于電泳分析。

將處理后的樣品加入到電泳膠的樣品槽中。電泳儀初始電壓一般設置為90 V。 待樣品進入分離膠，電壓可改為 120-160 V 運行，直至標示物溴酚藍遷移出電泳膠。 小心剝下電泳膠，準備染色。

考馬斯亮藍染色液的配制：稱取1 g考馬斯亮藍 R250 于450 mL的乙醇中，充分溶解。之后加入100 mL乙酸，攪拌混合，去離子水定容至1000 mL。

染色：將電泳后剝離的電泳膠放入染色液中，確保染色液充分覆蓋膠面。水平搖床上室溫下緩慢搖動，直至充分染色。

染色液倒出后用去離子水清洗電泳膠。加入適量脫色液后，水平搖床上緩慢搖動，室溫脫色， 期間根據實際情況更換脫色液。當電泳膠藍色背景基本脫除，蛋白條帶清晰即可停止脫色。更換電泳膠至去離子水中進行圖像采集，或更換至含甘油的保存液保存。

7.高效液相色譜分析

高效液相色譜分析使用 Agilent 1100系統。 TSK G5000 PWXL色譜柱。流動相為50 mM磷酸緩沖液。進樣體積為 100 μL，流速設定0.5 mL/min，UV 檢測器的設置檢測波長為 260 nm 和280 nm。

8.透射電鏡分析

密度梯度離心法純化得到的HBc-VLP及衍生物的顆粒形貌由FEI Tecnai 20透射電子顯微鏡檢測。在400目銅網上滴加少量樣品后1%乙酸雙氧鈾染色，水洗脫鹽干燥后觀測即可。

9.最后得出結論

此次研究的創新點便在操作過程中，我們打破了傳統的高速離心方法，采用光譜技術。光譜技術操作簡單，易于蛋白質活性，保持應用范圍廣，分離效率高。這不僅僅是簡單的創新，更是科技技術上的偉大創造。

通過這次科學實踐，我們學到了細菌培養實踐操作，蛋白質的分離純化，蛋白質的離心濃縮，蛋白質濃度的檢測技術，蛋白質純度的檢測技術等。