HPLC法測(cè)定頭孢他啶原料藥及制劑中雜質(zhì)頭孢他啶叔丁酯的含量

金燕燕

摘 要：目的：探討分析HPLC法測(cè)定頭孢他啶原料藥及制劑中雜質(zhì)頭孢他啶叔丁酯的含量 。方法：應(yīng)用高效液相色譜法，色譜柱C18，流動(dòng)相分別為乙腈溶液和磷酸鹽緩沖溶液，線性梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)255nm。結(jié)果：頭孢哌啶叔丁酯在0.01-1.22μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1%。結(jié)論：現(xiàn)有生產(chǎn)工藝在生產(chǎn)頭孢他啶藥物時(shí)，所殘留的CBE余量少，可以不需要進(jìn)行控制。高效液相色譜法具備較強(qiáng)的專屬性，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可以有效測(cè)定頭孢他啶原料藥、制劑中雜質(zhì)頭孢他啶叔丁酯含量。

關(guān)鍵詞：HPLC法;頭孢他啶原料藥;制劑;雜質(zhì);頭孢他啶叔丁酯

1 儀器與試劑

此次試驗(yàn)采用高效液相色譜儀，色譜柱為C18。CBE對(duì)照品，頭孢他啶原料藥，頭孢他啶碳酸鈉原料藥，頭孢他啶精氨酸原料藥，注射用頭孢他啶a，注射用頭孢他啶b。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法

2.1制備溶液

CBE對(duì)照品溶液制備：稱取12.2mgCBE，放置于容量瓶（100ml）中，添加流動(dòng)相A進(jìn)行溶解，并稀釋至刻度，獲得對(duì)照品溶液。

供試品溶液：精密稱取適量頭孢他啶原料藥，使用流動(dòng)相A溶解，稀釋為每1ml還有頭孢他啶50mg的溶液。搖晃均勻后過濾，獲得供試品溶液。

2.2色譜條件

色譜柱：C18。流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙腈-磷酸鹽緩沖溶液（稱取7.17g磷酸二氫銨加水溶液，稀釋至1000ml，使用氨溶液調(diào)節(jié)pH值至7）=7：93。流動(dòng)相B為乙腈-磷酸鹽緩沖溶液=25：75。線性梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為255nm，流速為每分鐘1ml，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10μL。

3 結(jié)果

3.1專屬性試驗(yàn)

選取五份頭孢他啶原料藥，置入不同容器中，開展光、酸、堿、高溫、氧化等破壞試驗(yàn)。按照試驗(yàn)結(jié)果可知，本文所設(shè)置的色譜條件能夠有效分離CBE和其他降解產(chǎn)物，并且和鄰近雜質(zhì)峰的分離度大于6，滿足要求，說明破壞程度較弱。選取2.1試驗(yàn)條件，分析對(duì)照品溶液，供試品溶液，氧化，高溫破壞試驗(yàn)溶液，結(jié)果如圖1所示：

通過圖1能夠看出，破壞試驗(yàn)會(huì)增加樣品的雜質(zhì)與含量，然而在CBD峰前、峰后，沒有產(chǎn)生新的雜質(zhì)。由于頭孢他啶對(duì)于酸、堿與光照的穩(wěn)定比較強(qiáng)，因此沒有列入到破壞試驗(yàn)色譜圖中。通過專屬性試驗(yàn)結(jié)果顯示，色譜條件具備適用性。

3.2線性范圍

精密量取0.5μL、1μL、2μL、5μL、10μL對(duì)照品溶液注入到液相色譜儀中，記錄色譜圖。以濃度作為自變量，峰面積作為因變量，建立線性回歸方程Y=2.01×106X+2.44×103（r=0.999，n=5）。結(jié)果顯示，頭孢他啶叔丁酯對(duì)照品溶液在0.01-1.22μg/mL范圍呈良好的線性關(guān)系。

3.3精密度試驗(yàn)

選取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)行6次進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1%，精密度良好。

3.4回收率試驗(yàn)

各稱取3份對(duì)照品，使用流動(dòng)相A溶解并稀釋為每毫升含有CBE0.08mg、0.10mg、0.12mg的溶液，將其作為對(duì)照儲(chǔ)備液。另外稱取10份頭孢他啶原料藥（約含500mg頭孢他啶），將其置于量瓶（10ml）中，其中9份分別加入對(duì)照儲(chǔ)備液1ml，按照外標(biāo)法測(cè)定。結(jié)果顯示，CBE平均回收率為99.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差為1.1%（n=9）。另1份用流動(dòng)相A溶解并稀釋作為空白供試品溶液，按照上述色譜條件檢測(cè)，結(jié)果顯示，在CBE峰位置沒有檢測(cè)出色譜峰。

3.5定量限與檢出限

選取6.11mg對(duì)照品，將其置入容量瓶（100ml）中，添加流動(dòng)相A溶解并稀釋到刻度，選取10μL、2μL、1μL、、0.2μL、0.1μL等不同劑量注入到液相色譜儀中，詳細(xì)記錄色譜圖。按照色譜峰高以信噪比等于10，得出CBE定量限為6ng;以信噪比等于3，得出檢出限為2ng。

3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

將對(duì)照品溶液放置于室溫下，在0h、1.5h、3h，4.5h，6h條件下進(jìn)行檢測(cè)，詳細(xì)記錄色譜儀，按照檢測(cè)結(jié)果顯示，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為0.2%，說明溶液在6小時(shí)內(nèi)的穩(wěn)定性顯著。

3.7耐用性試驗(yàn)

選擇兩種不同的色譜注測(cè)定同一種樣品溶液，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差低于1.5%，所以通過兩種色譜注檢測(cè)結(jié)果之間的差異不明顯，說明此種檢測(cè)方法具備良好的耐用性。

3.8樣品中CBE含量測(cè)定

按照上述方法對(duì)不同生產(chǎn)批量的樣品進(jìn)行檢測(cè)，并且和頭孢他啶相關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的，薄層色譜法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，薄層色譜法在樣本中均未檢測(cè)出CBE，高效液相色譜法檢測(cè)，頭孢他啶原料物的CBE含量為0.01%;檢測(cè)頭孢他啶碳酸鈉原料物的含量為0.02%，檢測(cè)頭孢他啶精氨酸原料物的含量為0.01%，檢測(cè)注射用頭孢他啶a的含量為0.03%檢測(cè)注射用頭孢他啶b的含量為0.02%，通過檢測(cè)結(jié)果能夠看出，頭孢他啶原料藥和制劑中，采用薄層色譜法，沒有檢測(cè)出CBE，通過高效液相色譜法檢測(cè)CBE的含量也比較少。說明現(xiàn)有生產(chǎn)工藝在生產(chǎn)頭孢他啶藥物時(shí)，所殘留的CBE余量少，可以不需要進(jìn)行控制。

4 討論

頭孢哌啶叔丁酯檢測(cè)濃度線性范圍為0.01-1.22μg/mL，平均回收率為99.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1%。選擇檢測(cè)波長(zhǎng)，選取適量CBE對(duì)照品，使用流動(dòng)相A進(jìn)行溶解，在波長(zhǎng)220nm-400nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，在255nm波長(zhǎng)位置存在最大吸收，因此選擇高效液相色譜法的檢測(cè)波長(zhǎng)為255nm。

頭孢他啶在色譜柱C18上容易洗脫，流動(dòng)相中加入緩沖鹽溶液，可以增加流動(dòng)相的極性，相應(yīng)延長(zhǎng)頭孢他定的保留時(shí)間。此次研究中，將乙腈-磷酸鹽緩沖溶液作為流動(dòng)相，按照色譜圖顯示結(jié)果，頭孢他啶和鄰近雜質(zhì)峰沒有有效分離，通過梯度洗脫方法，可以明顯延長(zhǎng)保留時(shí)間，有效分離頭孢他啶與CBE、CBE與其他雜質(zhì)峰。

綜上所述，通過此次研究結(jié)果顯示，說明現(xiàn)有生產(chǎn)工藝在生產(chǎn)頭孢他啶藥物時(shí)，所殘留的CBE余量少，可以不需要進(jìn)行控制。高效液相色譜法具備較強(qiáng)的專屬性，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可以有效測(cè)定頭孢他啶原料藥、制劑中雜質(zhì)頭孢他啶叔丁酯含量。

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